作者:董艺凝; 陈卫; 陈海琴; 赵建新; 陈永泉; 张灏 期刊:《食品与发酵工业》 2020年第02期
该研究以GH42家族嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源耐热β-半乳糖苷酶BgaB为研究对象,针对其转糖苷活性弱的问题,采用定点突变与化学修饰相结合的方法,对其预测亲核催化位点Glu303进行了功能研究与分子改造。所得突变体Ox-E303C与野生型酶相比,可将低聚半乳糖合成量由0%提高到11.5%。研究结果表明对耐热β-半乳糖苷酶BgaB亲核催化位点进行半胱氨酸亚磺酸(—SOO-)替换,能够提高其转糖苷催化活性。该研究对GH42家...
作者:蔡礼年; 黄春辉; 林陈水 期刊:《生物资源》 2015年第01期
为了获得高效融合表达的甲酸脱氢酶(FDH)工程菌,用PCR方法从毕赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)基因组DNA中克隆FDH基因,测序发现第106位多出一个脱氧腺嘌呤核苷酸,基因定点突变后重组至胞内融合表达型T载体pET-DsbA-T,得到重组质粒pET-DsbA-FDH,转化E.coli BL21(DE3),获得胞内融合表达型FDH工程菌。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白表观分子量约为65×103,主要以可溶形式存在于胞内。进一步研究得知,酶的最适温度为54℃,最适pH为8.5;...
作者:孙晓宇; 薄明井; 杨亚欣; 张惟材; 葛欣; 熊向华 期刊:《生物技术通讯》 2019年第05期
目的:考察甲基营养菌J1-1甲醇脱氢酶启动子活性与吡咯喹啉醌(PQQ)产量的相关性。方法:通过定点突变甲醇脱氢酶P0771启动子,利用lacZ作为报告基因检测突变启动子的转录水平,筛选出活性下降的突变启动子在J1-1中替换天然启动子获得突变菌株,检测突变菌株甲醇脱氢酶表达、酶活以及菌体生长和PQQ产量。结果:定点突变了7个P0771启动子,利用lacZ作为报告基因筛选出2个启动活性较天然启动子下降的突变启动子P0771-1、P0771-5,替换J1-1中天...
作者:李博华; 王皓; 杨扬; 陆斌; 王华菁; 张大鹏; 钱卫珠; 季军捷; 李晓东; 郭亚军 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2004年第01期
为了降低抗CD3人源化抗体hu12F6对T细胞的激活作用以克服首剂效应,构建了恒定区特定位点突变的hu12F6重链表达载体,将其与hu12F6的轻链表达载体共转染CHO细胞.ELISA和RT-PCR证实,恒定区特定位点突变的人源化抗体hu12F6m在CHO细胞中获得了表达.竞争抑制实验证实hul2F6m具有与原鼠源抗体及hu12F6相似的特异性和亲和力.增殖实验表明hu12F6m对T细胞的刺激作用明显弱于hu12F6。实验结果为深入探讨hu12F6m的生物学特性奠定了基础。
作者:陈惠; 赵海霞; 王红宁; 杨婉身; 吴琦; 倪燕 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2005年第02期
对来源于黑曲霉N25(Aspergillus niger China Strain)的植酸酶基因phyA进行PCR介导的定点突变,不改变其所编码氨基酸,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第81位和第85位的Arg密码子进行同义突变.构建了含正确突变的克隆载体pUC18-phyAm和酵母表达载体pPIC9kphyAm,电击转化毕赤酵母,经MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定,筛选出突变与未突变高酶活酵母转化子各2株.这4株转化子的Southern印迹结果表明,phyA基因以单交换方式...
作者:徐银凤; 赵雨; 孙迪; 张春枝 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2017年第11期
磷脂酶D是一类特殊的酯键水解酶,它能水解磷脂生成磷脂酸和羟基化合物,并能催化某些含羟基的化合物结合到磷脂的酰基上,形成新的磷脂,在食品和医药领域应用潜力巨大。本研究实现了蜡状芽孢杆菌磷脂酶D的克隆,并在大肠杆菌中成功表达。通常情况下,磷脂酶D存在2个HKD保守序列,以单体形式产生活性;少数原核生物中磷脂酶D只有1个HKD保守序列,以二聚体形式产生活性。通过酵母双杂实验发现,源于蜡状芽孢杆菌的磷脂酶D活性存在形式是单体...
作者:亓旭辉; 吴敬; 王蕾; 陈晟 期刊:《食品与生物技术学报》 2019年第10期
工业上将β-淀粉酶与其他淀粉水解酶进行复配可获得高纯度的麦芽糖浆。相对于目前常用的植物来源β-淀粉酶,微生物β-淀粉酶具有生产工艺简单、不受原料限制、质量稳定、纯度高等优势,但其最适作用pH多为6.0~8.0,难以与其他淀粉水解酶(pH多为4.5~5.5)进行复配。本实验室前期获得的弯曲芽孢杆菌β-淀粉酶其最适pH值为7.0,本研究在此β-淀粉酶基础上构建T47K,Y164K,L396K三个突变体,其最适pH由突变前的7.0分别下降为6.0,4.5,5.5,其中L396K...
作者:马立娟; 佟文哲; 杜丽平; 崔馨予; 马清; 肖冬光 期刊:《高校化学工程学报》 2019年第05期
裂解性多糖单加氧酶(LPMOs)辅助活性9家族蛋白(AA9)可有效促进纤维素酶降解纤维素。为研究N-糖基化对来源于黑曲霉的AA9蛋白AnLPMO15g与纤维素酶协同性的影响,采用定点突变的方法,将An LPMO15g中3个N-糖基化修饰位点(151、334、385)上的天冬酰胺用中性谷氨酰胺取代。结果表明,作用于微晶纤维素时,突变体N-151产生的还原糖量比AnLPMO15g提高了10.34%,突变体N-385产生的还原糖量降低了12.73%,突变体N-334变化不显著;作用于稻草粉时,3...
作者:孙菊鲜; 康春婷; 远宜彤; 李钊; 葛欣; 辛琪 期刊:《浙江农业科学》 2019年第12期
三孢布拉氏霉菌中carRA基因编码的CarRA为双功能酶,该酶的R结构域具有番茄红素环化酶的功能,是三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素合成途径过程中的关键酶,其酶活性的高低即环化能力的强弱决定了番茄红素的积累水平。为深入研究三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶的功能,以酿酒酵母菌株W303为出发菌株,首先构建了二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸高效合成的酿酒酵母底盘菌株W303-thmgr-Bts 1,在该底盘菌株中表达三孢布拉氏霉菌的carB和carRA基因,完成...
作者:王丽; 杨文理; 龚舒; 梅志强; 何涛 期刊:《西南医科大学学报》 2010年第01期
目的:利用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因中的突变碱基。方法:针对构建的重组质粒PGEM-7Z/HBcAg中的两处突变设计三对引物,PCR定点突变后对重新构建的PGEM-7Z/HBcAg进行菌落PCR和酶切鉴定,初步筛选的阳性克隆进一步通过序列分析进行确证。结果:经PCR定点突变后,测序证明HBcAg基因序列与设计完全一致。结论:用该方法成功纠正了人工合成的乙肝病毒核心抗原基因中两个碱基的缺失,获得了预期...
作者:石冬琳; 李艳秀; 钟黄欣; 陈正阳; 张子博; 张炜 期刊:《畜牧与兽医》 2019年第07期
温和噬菌体P88由溶原性大肠杆菌K88诱导得来,前期研究结果表明其尾丝蛋白的716-746位氨基酸为其受体识别的关键区域。本研究旨在确定该关键区域内的关键氨基酸位点。采用大肠杆菌无痕缺失的方法以溶源大肠杆菌K88的基因组为操作对象,将P88尾丝蛋白中的第716、719、721、722、725、730、734、736、744和746位的氨基酸分别定点突变为丙氨酸,丝裂霉素C诱导定点突变溶原菌K88,之后用P88的宿主菌DE048筛选和纯化定点突变噬菌体,并测定定...
作者:陈秀霞; 王亮亮; 张瑜; 李迅; 王飞 期刊:《林业工程学报》 2017年第03期
木聚糖酶广泛应用于食品、饲料、纺织、能源等领域。在生产过程中木聚糖酶的热稳定性较为重要,它直接影响酶的反应温度及使用效率。添加Ca^2+能够显著提高来源于Thermotoga thermarum DSM 5069的木聚糖酶Xyn10A在高温(85℃)条件下的热稳定性。为解析Xyn10A酶蛋白中的Ca^2+结合区域及热稳定性机制,笔者采用蛋白质结构模拟和定点突变技术以确定该结合区域,并分析其对于酶热稳定性的影响机制。酶蛋白的建模和结构比对结果表明,GH1...
作者:彭平平; 黄利鸣; 王艳林 期刊:《时珍国医国药》 2010年第05期
目的天然天花粉蛋白(TCS)是一种拥有抗肿瘤、抗病毒的核糖体失活蛋白,但在临床应用时有细胞毒性强和诱导严重过敏反应等不良反应。利用基因工程技术和化学修饰的方法对天然TCS进行改造和修饰,以期获得高效、低毒和低免疫原性的TCS供临床和研究使用,是当前研究的热点课题,文章综述了该领域的新近研究进展。
作者:张恒; 何成强; 李云龙 期刊:《动物医学进展》 2004年第02期
以本实验室克隆保存的含野生型鸡贫血病毒(CAV)全基因序列的pUC18-CAV为模板,通过双向聚合酶链式反应(PCR)的方法在CAV的DNA序列中制造定点突变并新增特定限制性酶切位点,得到载有CAV突变体的pUC18-CAVm.突变体中致病基因vp3的起始密码子ATG(在mRNA是AUG)突变为ACG而失去翻译起始位点的功能,虽然vp3基因完全重叠于vp2基因内部,但由于读码框的不同和密码子的简并性,突变位点的碱基变化并未引起VP2蛋白的氨基酸残基序列发生变化,从而...
作者:刘玉姣; 高金鹏; 刘娇娇; 李多川 期刊:《菌物研究》 2018年第01期
糖苷水解酶第一家族(GH1)β-葡萄糖苷酶(BGL1)有葡萄糖耐受性,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性有很大影响,但具体作用机制尚不清楚。对嗜热革节孢GH1 BGL1进口端的W168、L173、F348、W349、C169、F180、D237、Y179、A260、H307、N335和E437这12个氨基酸残基进行定点突变,将突变酶与野生酶(WT)在毕赤酵母中表达,表达产物纯化后进行酶活性和葡萄糖耐受性测定。与WT相比,所有突变酶活性均有所降低,其中W168H、N335F和W349G几乎...
作者:邱锦; 黄火清; 姚斌; 罗会颖 期刊:《生物技术通报》 2019年第09期
α-淀粉酶(α-amylase)是一类作用于淀粉内部水解其α-1, 4 糖苷键从而将淀粉水解为糊精、低聚糖和单糖的酶。该类酶已被广泛应用于面包生产及洗涤等工艺中。从分子水平上改造淀粉酶,以提高水解活力及催化效率,已经成为多年的目标,也具有重要的研究意义。以目前广泛应用的来源于解淀粉芽孢杆菌的中温中性淀粉酶 BAMYA 出发,通过理性设计在该淀粉酶的C 端结构域设计突变位点,利用定点突变提高其水解活力,并在枯草芽孢杆菌中实现高效表...
作者:陈少威; 吴程; 苏月华; 蔡斌斌; 谢盼盼; 杨梅 期刊:《生物技术通报》 2018年第11期
为了研究苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine Lactonase,AiiA蛋白)表达调控机制,确定aiiA的启动子区域。本研究克隆了aiiA的5’端侧翼区(aP-1930--1),以gfp作为报告基因,分段克隆aiiA的5’侧翼区,鉴定启动子活性,并对aiiA启动子序列中的碱基对-150和-142之间的2个连续的TATA盒进行定点突变。结果显示,侧翼序列aP-295--101和aP-295--1可作为启动子,实现GFP在大肠杆菌中的异源表达,启...
作者:孟浩毅; 李丹阳; 孙正阳; 杨兆勇; 张志斐; 袁丽杰 期刊:《中国生物工程》 2018年第05期
研究人类线粒体肌酸激酶uMtCK的结合位点,将其与底物肌酸和ATP结合有关的关键氨基酸进行突变,并对突变体进行酶动力学和圆二色谱数据分析,探讨这些关键氨基酸在底物识别和催化过程中的作用。结果显示,与野生酶相比,突变体Q313A和R336A的KmCr分别提高了2.6和2.9倍,kcat下降了19%和55%;同样地,与ATP结合相关的突变体R125A和R287A分别使得KmATP升高了3.2和4.2,kcat下降了72%和38%。以上结果表明突变体R125A、R287A、Q313A和R336A影响...
作者:阚婷婷; 宗迅成; 苏永君; 王婷婷; 李闯; 胡蝶; 邬敏辰 期刊:《中国生物工程》 2019年第06期
环氧化物水解酶能够对外消旋环氧化物进行动力学拆分保留单构型的环氧化物。测定了菜豆环氧化物水解酶(PvEH1)针对苯基缩水甘油醚及其甲基衍生物的催化特性,并基于分子对接及多序列比对分析确定7个突变位点,通过单点和组合突变对PvEH1进行改造,以期改善PvEH1对邻甲基苯基缩水甘油醚(1a)的催化特性。底物谱分析表明PvEH1对1a的催化活性(157.2U/g湿细胞)和对映选择性(E=5.6)最高。单点突变结果显示E.coli/pveh1 L105I和E.coli/pveh1^...
作者:贾笑英; 张金文; 王蒂 期刊:《农业生物技术学报》 2005年第05期
体外定点突变技术比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变率高、简单易行、重复性好的特点,已在生物和医学领域广泛应用.已报道的一些体外突变方法Ⅳande-yar et al.,1988;Sugimoto et al.,1989),一般需以单链DNA为模板,并要求对突变基因进行亚克隆和对单链DNA拯救,技术上较复杂,多数需1周以上时间.采用突变试剂盒可以在短时间内完成突变过程,但试剂盒价格昂贵,使用次数有限.我们根据Pfu酶的特性,自行设计了突变反应和方...