[关键词] Toll样受体；基因多态性；脓毒症
[中图分类号] R631 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）25-22-03
Study of Toll-like Receptor Gene Polymorphism in Sepsis
WANG Zhiyi SUN Laifang
Department of Emergency，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China
[Abstract] Sepsis is defined as the systemic inflammatory response of the body to an infection. Numerous studies show that the susceptibility and clinical outcome of sepsis associated with the different genetic background. This review summarizes the research on relationship between the sepsis and Toll-like receptor gene polymorphisms.
[Key words] Toll-like receptors；Gene polymorphisms；Sepsis
脓毒症是感染引起的全身性炎症反应综合征，是创伤、烧伤、术后感染和危重病的常见并发症，可进一步发展成严重脓毒血症、脓毒性休克和器官功能障碍综合征，甚至死亡。流行病学调查显示[1]，脓毒症的发病率和死亡率随年龄的增长而增加，且黑人脓毒症易感性比白人高，死亡率也明显高于其他人种，可见机体的遗传因素对脓毒症的易感性和临床转归具有重要的作用。为进一步证实遗传因素对脓毒症的作用，2001年国际脓毒症定义会议建议将遗传背景因素作为脓毒症病因的重要组成部分进行研究。近年来，国内外对脓毒症的基础与临床研究十分重视，大量研究表明Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）与脓毒症的发病机制有关[2]。本文就脓毒症与TLRs基因多态性研究作如下综述。
1Toll样受体
TLRs是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子。1980年，Nusslein-Volhard等在研究果蝇胚胎发育过程中发现一个决定果蝇的背腹侧分化的基因，将其命名为Toll基因。目前，在人类中已经发现的TLRs家族成员有11个，根据染色体的位置、基因结构和氨基酸序列，可分为5个亚科，即TLR2（包括TLR1、TLR2、TLR6和TLR10）、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9（包括TLR7、TLR8和TLR9）。TLRs结构包括胞外富含亮氨酸的重复序列（LRR），跨膜区，胞内Toll/IL-1受体结构域。TLRs介导的信号途径包括激活NF-κB、MAP激酶、干扰素调节因子（interferon regulatory factors，IRFs），从而释放细胞因子、化学增活素、干扰素与免疫球蛋白，在宿主防御免疫反应方面起着重要作用。1997年，Medzhitov等报道了与果蝇同源性的人类Toll，当其过多表达时可活化NF-κB，并诱发刺激分子表达[3]。
2TLRs基因多态性与脓毒症
基因多态性是指在一个遗传座位上具有一个以上的等位基因，且各个等位基因在群体中的出现频率皆高于1％，是人体对疾病易感性与耐受性、临床表型多样性及药物治疗反应差异性的重要因素。研究发现TLRs、肿瘤坏死因子TNF等炎症因子、丝裂原活化抑制因子（PAI-1）、人白细胞抗原（HLA）和热休克蛋白（HSP-70）等基因多态性均与脓毒症有关。目前，研究较多的是TLRs基因多态性。
2.1 TLR4基因多态性与脓毒症
Poltorak等[4]和Qureshi等[5]用遗传学方法发现，携带C3H/HeJ和C57BL/lOScCr基因的两株小鼠表现为对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）高度耐受性和对革兰阴性菌感染高度易感性。前者为TLR4基因第3外显子的错义突变致TLR4基因编码产物多肽链第712位上的脯氨酸被组氨酸所取代，后者为TLR4基因存在无义突变。这种基因突变或多态性解释了同种个体间对脓毒症易感性的差异和不同种属对部分脂多糖结构反应不同，表明TLR4基因是调节LPS反应的关键。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）研究是最常见的基因组学研究方法。目前对TLR4的SNP研究主要集中在Asp299Gly（299位天门冬氨酸与甘氨酸的置换）和Try399Ile（399位苏氨酸与异亮氨酸的置换）2个位点的突变。Arbour等[6]通过转染Th.1细胞发现Asp299Gly位点的突变可干扰TLR4介导的LPS信号转导通路，降低呼吸道上皮细胞对人LPS的刺激反应性。Agnese等[7]研究表明Asp299Gly/Thr399Ile突变可是使革兰氏阴性菌感染发生率明显升高。Lorenz等[8]发现单纯Asp299Gly多态性只存在于感染性休克患者中，且有等位基因TLR4 Asp299Gly/Thr399Ile的患者易发生革兰阴性菌感染。Barber RC等[9]研究发现，烧伤患者TLR4的Asp299Gly突变可增加其发生严重脓毒症的危险性。Shalhub等[10]认为TLR4基因的突变与创伤后脓毒症的严重性相关，并认为这种相关性可能不仅是由Asp299Gly单核甘酸多态性引起的，也可能与TLR4其他位点的突变协同导致。
以上研究表明TLR4基因多态性与脓毒症的发生、发展有密切关系，但也有不少研究得出阴性结果。Jessen等[11]研究显示，TLR4的基因多态性与革兰氏阴性菌引起的脓毒症无明显相关性。Feterowski等[12]对多种微生物感染引起的术后脓毒症进行研究，结果显示脓毒症的发生率及死亡率与TLR4位点的突变无相关性。Kumpf[13]，Taudoff[14]等认为Asp299Gly与Thr399Ile的突变与脓毒症细胞因子的变化无明显相关性。国内学者也有类似报道[15]，单小鸥等[16]研究发现TLR4基因（Asp299Giy、Thr399Ile）多态性与温州地区汉族儿童脓毒症易感性无明显相关性。因此，TLR4基因多态性与脓毒症相关性及参与因素的影响仍有待进一步研究。
2.2TLR2基因多态性与脓毒症
TLR2是TLRs家族中的主要成员之一，是宿主防御细菌、真菌及病毒感染的识别受体。目前已发现TLT-2基因存在两种多态性：Arg753Gln（TLR-2-Ⅰ）和Arg677Trp（TLR-2-Ⅱ）。前者与脓毒症的发生有关，后者与瘤型麻风的发生有关[17]。研究表明，TLR2基因敲除小鼠对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的易感性明显增强，对螺旋体的易感性也较野生型的高[18]。Lorenz等[19]对91例脓毒症休克患者进行TLR2基因分析，发现2例患者具有Arg753Gln多态性，且都伴有金黄色葡萄球菌感染。Thuong等[20]对358名越南结核患者研究发现，TLR2基因多态性与肺结核和结核性脑膜炎的易感性有关。以上研究表明，TLR2基因的变异可能增强机体对致死性细菌的易感性。而Moore CE等[21]对420例金黄色葡萄球菌感染患者进行研究，结果显示TLR2的Ar9753Gln基因多态性与机体对金黄色葡萄球菌的易感性和严重程度不相关。宋振举等[22]研究也显示，TLR2基因多态性与中国汉族人群的重症社区获得性肺炎易感性和预后无明显相关性。因此，TLR2基因多态性与脓毒症的确切关系尚需进一步的研究证实。
2.3TLR5基因多态性与脓毒症
TLR5在细菌鞭毛诱导的炎性反应中起核心作用。Lissauer等[23]研究表明，脓毒症患者TLR5的表达较正常人群显著增高。TLR5基因内存在3个频率较高的编码性单核苷酸多态性位点。其中两个错义多态性位点592N（rs2072493）和L616F（rs5744174）位于TLR5的胞外区，为引起氨基酸发生改变的SNP位点。另一个多态性位点R392X（rs5744168）是无义突变，可引起11LR5的跨膜结构域和胞内部分的完全缺失，该位点与发生军团菌引起的肺炎的高风险相关[24]。以上研究表明LR5很可能是脓毒血症的易感基因，其遗传学变异可能会影响TLR5的功能。而王志富等[25]对中国255例脓毒症患者和260例对照个体的3个cSNP（rs5744168，ra5744174和rs2072493）进行研究，结果显示以上3个导致氨基酸发生改变的SNP位点与脓毒血症的易感性和严重程度无显著关联，但不排除其它未进行研究的TLR5基因多态性可能会影响脓毒血症的发生、发展和转归。
2.4Toll样受体基因多态性的种族差异对脓毒症的影响
在TLRs基因多态性与炎性应答损伤的遗传易感性研究中，不同种族及地区的研究结果往往不同。通过对比中国汉族与其他种族TLR4基因的Asp299GIy、Thr399Ile和TLR2基因的Ar9753Glu、Ar9677Trp多态性分布，发现不同种族及地区人群的等位基因频率及基因型频率的分布有差异。吕欣等[26]检测了健康汉族人群及缺血性卒中患者DNA样本，未发现Asp299Gly和Thr399Ile基因多态性。Hang等[27]也认为TLR4基因编码区Asp299Gly和Thr399Ile基因多态性在中国人群中非常罕见。其他类似研究也表明中国浙江汉族人[28]、中国湖北汉族人[29]与日本人的等位基因频率及基因型频率相似，均未检测到TLR4基因Asp299Gly、TLR2基因Ar9753Glu和Ar9677Trp的突变位点，而德国人TLR4基因的Asp299Gly突变频率5.6％、Ar9753Glu突变频率9.4％，西班牙人Ar9753Glu突变频率1％[30]，突尼斯人Ar9677Trp为31％[31]。lorenz等[8]、Agnese DM等[32]、Read等[33]分别调查了73例美国人、39例美国人、879例英国人和80例苏格兰人（均为健康白种人），发现Asp299Gly携带者的比例分别为13％，11％，10.5％，10％。据Smirnoval等[34]统计，欧洲人种多为Asp299Gly/Thr399Ile单倍型，Asp299Gly单倍型在非洲人中出现频率更高，在亚洲人中这2种突变均极为罕见，也证实了大部分研究中出现这2处基因突变的人群都为白种人或非洲人。
3结语
尽管有大量研究表明Toll样受体基因多态性与脓毒症的发生、发展有关，但仍需进一步研究证实。通过不同遗传背景人群的研究，可以初步推测我国汉族人群中TLR4基因多态性Asp299Gly携带者的比例较西方白种人低。TLRs基因多态性的种族差异研究使我们认识到遗传背景的不同可能会影响其基因多态性在感染性疾病发病中的作用。为脓毒血症临床诊疗提供新的思路、方法和途径。
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【关键词】 冠心病;三磷酸腺苷结合盒转运子a1;多态性
the association between abca1 gene r219k polymorphism and coronary heart disease. zhang xiong_xin, xu li_xin, zhang huai_qin，et al. the first affiliated hospital of medical college, zhejiang university, zhejiang 310003, china
［abstract］ objective to explore the association between atp binding cassette transporter 1（abca1） gene r219k polymorphism and coronary heart disease(chd) in chinese han population. methods using polymerase chain reaction_restrictive fragment length polymorphism (pcr_rflp), 162 chd patients and 186 controls were analyzed for the polymorphism, genotype and allele distribution of abca1 gene r219k. results the distribution of abca1 genotype in both groups was in hardy_weinberg equilibrium. the frequency of rk and kk genotype in control group was significantly higher than that in chd group(73.66% vs 56.17%,p＜0.05); similarly, the frequency of k allele in control group was significantly higher that in chd group (48.66% vs 36.11%, p＜0.01).after adjusted for the influence of age, gender and other chd risk factors by multiple logistic regression analysis, those people who have at least one allele markedly decrease chd risk （or=0.38, 95%ci=0.22-0.65）. conclusions abca1 gene r219k polymorphism is associated with chd risk in chinese han population, k allele may serve as a genetic protective factor for coronary heart disease.
［key words］ coronary heart disease; atp binding cassette transporter 1; polymorphism
流行病学研究显示低血清高密度脂蛋白胆固醇(hdl_c)水平是冠心病独立的预测因子和重要的危险因素。血浆hdl_c水平受许多遗传和环境因素的影响，abca1活性是血浆hdl_c水平的一个重要决定因素［1］，abca1在胆固醇逆转运过程中起第一步限速作用［2］。近来，国外文献报道，abca1基因的某些单核苷酸多态性与chd易感性有着一定的关联性,其中r219k多态性在不同人群中表现为与降低的chd危险性相关［3,4］。本文探讨中国温州汉族人群冠心病患病风险和abca1基因r219k多态性的关系,并分析这个多态性对血脂的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料：病例为（2004年1月至2006年7月）温州医学院附属第一医院心血管内科住院的患者。冠心病组162例，其中男121例,女41例，年龄48～81(平均68.3±10.4)岁。冠心病组中74例为急性心肌梗死患者，急性心肌梗死的诊断标准符合中华医学会心血管病学分会2001年修订的《急性心肌梗死诊断和治疗指南》中的诊断标准［5］，其余病人均经冠状动脉造影证实，即左主干、右冠、左前降支、左回旋支中有一支以上狭窄≥50%。对照组186例，其中男123例,女63例，年龄45～76(平均63.5±10.3）岁。对照组中，52例为经冠状动脉造影排除冠心病的同期住院患者，其余对象为同期在我院体检中心体检的健康对照（均无冠心病史，心电图检查无冠心病证据，并且排除恶性肿瘤，免疫炎症性疾病和肝肾功能不全者）。所有的研究对象均来自汉族人群，无亲缘关系。
1.2 方法：
1.2.1 血脂水平的检测：研究对象均采用空腹12h后抽取外周血5ml测定血脂水平。tg和tc(总胆固醇)采用氧化酶法测定,hdl_c、ldl_c(低密度脂蛋白胆固醇)用直接法测定。
1.2.2 基因组dna提取：抽取研究对象的空腹静脉血2ml,以edta抗凝。采用人类基因组dna提取试剂盒(gentra公司)从300ul全血中提取基因组dna，然后放在-70℃下保存。
1.2.3 pcr和基因定型：pcr引物根据genbank所收录的全序列(登录号:nm-005502)并参照文献［6］,由上海生物工程公司合成,上游引物：5'_gcaaggctaccagttacatttgacaag_3',下游引物：5'_gattggcttcaggatgtccatgttgg_3'。反应使用mastercyler 533型pcr扩增仪。pcr体系为20μl，含有基因组dna0.2～0.6μg，上下游引物各0.5umol/l，0.2mmol/l的4种dntp，2.0mmol/l的mgcl2，1u taq dan聚合酶，10×buffer 2μl，用去离子水补充至20μl。扩增程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性1分钟、56℃退火30秒、72℃延伸45秒，共35循环；最后72℃延伸7分钟，扩增出大小为166bp的dna片段。扩增产物用xagi特异性限制内切酶在37℃水浴消化4小时后，2.5%琼脂糖凝胶电泳并在凝胶成像系统里判断酶切结果。
1.3 统计学分析：用spss13.0软件包进行统计分析。计量资料的组间比较采用t检验，两组以上比较采用方差分析，计数资料的组间比较采用卡方检验。基因型和等位基因与冠心病的相关性采用比数比(or,odds ratio)及其95%的可信区间(ci, confidence intervals)来表示，并用logistic回归来排除年龄，性别，以及冠心病的其他危险因素的影响。检验水准采用p=0.05。
2 结果
2.1 两组临床资料比较：两组间性别构成比以及血浆tc、ldl_c、hdl_c水平差异无显著性，其余的均具有统计学差异。在多因素统计分析中对这些因素进行了校正，见表1。表1 冠心病组和对照组临床特征比较
2.2 基因型鉴定：含r219k多态性位点的pcr扩增产物长166bp，k等位基因存在限制性内切酶xagi切点,从而导致3种基因型的出现:rr型(无酶切位点的纯合子),酶切后长度仍为166bp;kk型(存在酶切位点的纯合子),酶切产物为101bp和65bp两个片段;rk型(3种片段的杂合子),酶切产物为166bp、101bp、65bp的3个片段(图1)。
2.3 基因型和等位基因频率比较:表2和表3示abca1基因型和等位基因在冠心病组和对照组中的分布情况。两组基因型的分布均符合hardy_weinberg遗传平衡定律。在162例冠心病人中，基因型的分布为rr71例，rk65例，kk26例；而186例对照中，基因表2 冠心病组和对照组abca1基因r219k基因型频率的比较注：两组比较，*p＜0.01表3 冠心病组和对照组abca1基因r219k等位基因频率的比较注：两组比较，*p＜0.01
型的分布为rr49例，rk93例，kk44例，两组分布具有显著性差异（x2=12.06,p＜0.01）。冠心病组r等位基因频率为63.89%，k等位基因频率为36.11%；对照组r等位基因频率为51.34%，k等位基因频率为48.66%，两组分布具有显著性差异(x2=11.13,p＜0.01)。调整年龄、性别、体重指数、吸烟和高血压等因素后，携带219kk基因型的个体较219rr携带者罹患冠心病的风险显著减少(or=0.34;95%ci=0.18-0.69),而携带至少1个219k等位基因的个体也显著减少患冠心病的危险(or=0.38;95% ci=0.22-0.65)。
2.4 不同基因型患者间血脂水平的比较:将正常对照组分成k等位基因携带者和非携带者两个亚组,比较两个亚组间血清血脂成分水平的差异。k非携带者血清tg和ldl_c高于k携带者，k携带者hdl_c高于k非携者，两型比较均未见显著统计学意义（p＞0.05），见表4。表4 对照组不同基因型患者间血脂水平的比较
3 讨论
本研究在中国温州汉族人群中进行abca1基因r219k多态性与冠心病遗传易感性的关联研究。研究人群abca1基因r219k多态性的分布符合hardy_weinberg遗传平衡定律，表明该人群具有较好的代表性。本文结果显示，正常对照组r219k位点（rk+kk）基因型和k等位基因显著高于冠心病组,提示k等位基因携带状态是冠心病发病的一个保护因子,k等位基因携带者血清hdl_c水平高于rr基因型者，但未达显著统计学意义。
低hdl_c水平是发生冠心病及严重程度的一个主要的独立的危险因子。hdl_c的抗动脉粥样硬化的功能与它促进胆固醇从外周细胞转运到肝脏(即胆固醇的逆向转运)有关［7］。1999年，人们阐明abca1基因缺陷是tangier病的病因。tangier病是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病,是由于abca1基因的突变使细胞内胆固醇流出障碍,导致网状内皮细胞及巨噬细胞内胆固醇沉积所致,主要表现为极度减少的血浆hdl_c水平,胆固醇的外流减少和明显增加的冠心病患病风险［8］。之后，人们发现abca1基因变异与血清hdl_c水平变化密切相关。abca1活性是血浆hdl_c水平的一个重要决定因素［1］,突变可导致胆固醇代谢异常。
人类abca1基因位于9q31,约149kb,包括1453bp启动子及50个外显子,其所编码的abca1是由2261个氨基酸组成的膜蛋白。abca1促进细胞内的胆固醇和磷脂(主要是卵磷脂)转运至hdl前体apoa,因此该蛋白在逆转运过程中起第一步限速作用。abca1基因在白细胞、巨噬细胞和肝、肺、肾上腺及胎盘组织高度表达。此外，作为胆固醇转运子，abca1可以保护内皮的信号传导通路，已经发现abca1杂合子会损害一氧化氮活性，影响内皮功能［9］。
至今为止，已发现90多个与疾病相关的abca1基因变异或snp位点,这些snp在人群中的发生率差异很大。r219k多态是abca1基因第219密码子ga转换,导致arglys氨基酸替代，可能会影响蛋白质的功能。国外报告，这个多态性与冠心病的危险性相关，k等位基因是冠心病的保护因子［3,4］。对于是否同时伴有血浆hdl_c水平显著改变，研究结果并不一致。我们中国温州汉族人群中的研究结果显示对照组的rk和kk基因型的频率显著高于chd组（73.66%比56.17%,p＜0.05），同样,对照组k等位基因的频率显著高于chd组（48.66%比36.11%，p＜0.01）。调整年龄、性别、体重指数、吸烟和高血压等因素后，携带至少1个219k等位基因的个体显著减少患冠心病的危险(or=0.38;95% ci=0.22-0.65)。因此，可以认为abca1基因r219k多态性与中国温州汉族人群冠心病的遗传易感性相关，其中k等位基因是冠心病的保护因子。
冠心病组的血脂水平可能受到调脂药物治疗和心肌梗死事件的影响,关于血清脂质水平和基因变异的相关性我们仅在对照组中进行。本文结果显示，对照组中k等位基因携带者血清hdl_c水平与非携带者相比，两者未见显著差异，与frikke_schmidt等［10］研究相似。因此，我们推测单个r219k核苷酸多态性对血清hdl_c水平影响甚微，r219k多态性可能跟其它多态位点有连锁作用，或者r219k的功能效应只在特定的遗传和环境背景下才具有显著意义，有待进一步研究。
总之，本文结果提示abca1基因r219k多态性与中国温州汉族人群冠心病的遗传易感性相关，其中k等位基因可能是冠心病的保护因子，这种作用不伴有血浆hdl_c水平的显著改变。今后尚需大样本的进一步研究证实。
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【关键词】缺血性脑血管病基因多态性
中国图分类号:R543 文献标识码:A 文章编号:1005-0515(2010)08-084-02
1概述
脑血管病(CVD)是由脑部血液循环障碍而导致的以局部神经功能缺失为特征的一组疾病。脑血管病是最常见的神经科疾患,缺血性脑血管病(ICVD)约占全部CVD的70%～80%。基因多态性是指在一个生物群体中,存在着两种或两种以上不连续的变异型或基因型或者等位基因,亦称遗传多态性。常见的基因多态包括限制性片段长度多态性(RFLP)、DNA重复序列的多态性、单核苷酸多态性等。不同群体或个体在对疾病的易感性以及对同一药物的反应性方面的差别, 是长期进化过程中基因组与内、外环境相互作用的结果。研究群体基因组多态性不仅可以发现人类起源、进化、迁徙等规律,而且对疾病的预防、诊治策略产生深远的影响。理想的基因多态性研究方法应该具有灵敏度高、简便、快速、准确且经济实用等优点。传统的RFLP的检测多用Southern印迹杂交法或用限制性内切酶识别消化结合电泳的方法。为扩大检测突变范围,可结合聚合酶链反应(PCR)使用PCR-RFLP法。通常应根据基因变异的类型采用不同的分析方法,如基因缺失可用基因探针杂交,PCR扩增直接检测。点突变可用单链构象多态性(SSCP)、放大受阻突变系统(ARMS)、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交、扩增片段长度多态性(AFLP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、ASO引物PCR、DNA测序等直接检查。近年来又出现一些新的研究方法,如变性高效液相色谱(DHPLC)技术、荧光定量PCR技术(TaqMan PCR)、侵入检测技术、Snapshot、分子灯塔技术、基因芯片(DNA芯片)等。
2..与IVCD治疗的相关基因多态性研究
抗血小板,他汀类调脂药,神经营养因子等应用广泛,作为基因表达产物有其特定乃至唯一的治疗靶点,重点针对其基因多态性进行研究可能提供有益的临床参考。血小板糖蛋白是存在于血小板膜表面的一种糖蛋白,对血小板活化及血栓的形成起关键作用。GPIb是血小板膜上含量最多的糖蛋白,研究发现GPIb复合物的作用、表达和免疫原性受GPIb a的多态性影响。Baker, R. I 等研究了GPIb 的Kozak T/C 、变数串联重复(VNTR)、 人类血小板抗原2A型三种多态性变异后发现,Kozak T/C多态性增加GPIb alpha表达,是首次缺血性中风的一个独立危险因素[1]。VNTR多态性的GPIb在我国汉族中占一定比例,东北部汉族仅见alpha链B,C,D基因型,CC基因型的VTNR多态性似乎对低剂量的阿司匹林更为敏感[2]。血脂代谢异常与IVCD关系密切,载脂蛋白E (APOE)基因多态性与心脑血管事件的相关研究较多。VCD发病可能与糖尿病,高血压,和/或肥胖相关, McCarron, M. O等发现[3],ApoE基因epsilon4等位基因与脑血管病发病更为密切,而epsilon2等位基因似乎对CVD无保护作用,而Kostulas, K等对经过校正年龄和性别的资料显示:APOE并没有与ICVD相关[4]。非胰岛素依赖型糖尿病高胆固醇血症患者降脂治疗显示:具有APOE E3/E2基因的患者,他汀类药效较差[5]。近年来关于肿瘤坏死因子,细胞间粘附分子等与ICVD的相关性文献很多,神经营养因子临床应用也比较广泛,脑源性神经营养因子(BDNF)基因位于染色体 11p13,编码小分子二聚体蛋白-BDNF,与神经元的生长、存活以及功能性突触的构建有关,是神经精神疾病发病机制研究的重要侯选基因。关于BDNF多态的研究主要为动物试验和AD患者,目前尚缺乏与IVCD的报道。有认为BDNF C270T多态性或其他未知的多态性的连锁不平衡,使患者易感性晚发性痴呆[6]。
3小结
国内外研究的IVCD有关的侯选基因多态有凝血和纤维蛋白溶解系统相关基因、血脂代谢相关基因、细胞因子相关基因、动脉粥样硬化相关基因等。进入21世纪以来,基因多态性的研究不断提速,越来越多的基因功能被发现和明确,我们也可以从中发现更多药物敏感基因,临床应用中选择更好的治疗靶点,进而针对敏感基因群体进行疾病防治,有利于我们更合理利用卫生资源。
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关键词：GBA；基因突变；基因多态性；帕金森病
帕金森病（PD）在临床上以动作迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势反射障碍为主要临床表现；除外运动症状方面，帕金森病同时有多种非运动症状（NMS），其主要包括精神障碍如痴呆、抑郁症等和植物神经功能紊乱等[1]。出现运动症状的病理学基础是在黑质纹状体中逐渐出现多巴胺能神经元变性（SNc），并伴有嗜酸性粒细胞胞浆内蛋白质的聚集，这些聚集的蛋白质主要成分是α-突触白，形成目前公认的路易小体和路易神经突，这些是帕金森病的主要病理特征。
1 GBA基因基本结构及生物学功能
β葡萄糖脑苷脂酶（GBA）基因定位于人染色体1q21，全基因长7.6kb，含有11个外显子。该基因编码葡萄糖脑苷脂酶，是一种溶酶体酶，该酶有536个氨基酸组成，能将葡萄糖脑苷脂水解为神经酰胺被机体所利用。
有关葡萄糖脑苷脂酶的生物学功能，有学者在分子生物学水平研究发现，α-突触白（α-synuclein，SNCA）的聚集是通过细胞与细胞之间的一个循环运输进行，这个循环包括吸收外部聚合体，与内生SNCA共聚集以及该共聚体的胞外分泌三个步骤；进一步研究发现GBA的耗损促进了α-突触白共聚体的传递，这更增加了认知功能方面的损害。这些研究都明确了α-突触白共聚体在神经细胞内的运输方式，这一研究结果可能为GBA基因多态性增加了PD及其他蛋白病发病风险也作出了解释[2]。
2 GBA基因多态性与帕金森病
在戈谢病亲属中患帕金森病的发生率逐渐增加致使研究学者对于散发性PD群体进行GBA基因突变筛查[3]。在具有德系犹太人血统的以色列人口中，PD患者与健康对照组相比显示出更为高比例的杂合GBA突变频率[4]。
2009年，选取来自四大洲16个参与中心的5691例PD患者进行多中心分析，结果发现其中至少有两种最常见的GBA基因突变（包括L444P、N370S）；研究证实，杂合GBA基因突变是目前PD的遗传危险因素之一[5]。
最近，另一项研究选取了4例携带有三种不同杂合GBA基因突变（L444P、N370S、N462K）的PD患者，将其与没有携带GBA基因突变的PD 患者进行对照，结果发现有无GBA基因突变是在疾病发展过程中一个重要预测标志，尤其是在认知功能及运动症状方面[6]。
2.1 GBA基因多态性在帕金森病中存在的可能致病机制 GBA基因相关的PD患者存在的潜在发病机制目前仍是需要进一步研究探索的。在GD动物和细胞模型中，可观察到通过提高卵磷脂酰基转移酶（CCT）的活性可增加卵磷脂（PtdCho）的合成，其中卵磷脂是细胞膜的一个重要磷脂组成部分[7]。改变细胞膜的双分子脂质层结构可导致α-突触白膜的破坏，并增加胞质中具有毒害神经作用的纤维形成[8]。
此外，研究结果也表明膜结合的α-突触白（SNCA）与GCase 酶存在两者之间相互作用，并可抑制酶的活性。目前有关于这种抑制状态出现的原因存在有两种不同的假设：①由于膜结合α-突触白与GCase 酶相互之间的直接作用结果所致；②由于膜结合α-突触白的内部作用导致细胞膜脂质双分子层结构受到干扰，这种抑制状态是这一过程所引起的附带效应。这两种假设其中哪一种更为正确尚不清楚[9]。对GBA基因相关的PD患者进行31P磁共振频谱成像 （31 P-MRSI），我们发现携带有GBA基因多态性的PD患者存在有大量的神经元缺失，在这神经元缺失的大脑区域中可见细胞核内磷脂代谢的紊乱[10]。
2.2与帕金森病相关的GBA基因突变位点
2.2.1 N370S 突变位点 N370S突变位点是最常见的GBA基因突变位点。既往的研究都显示N370S的位点突变在中国戈谢病患者中却极为罕见[11]。但国内有一项研究显示，GBA基因N370S位点的突变可能与晚发型PD的发病具有一定关联性[12]。对此可能的解释是：①二次世界大战期间大量的犹太人涌入中国；②13世纪丝绸之路使得更多犹太人在中国定居和贸易往来[13]。
2.2.2 L444P 突变位点 L444P位点的突变频率仅次于N370S位点，研究显示在早发性PD及晚发性PD患者与对照组人群相比，出现的GBA基因L444P位点多态性均明显增高，但是否携带有L444P突变在疾病临床特征（如性别、发病年龄、首发症状、Hoehn-Yahr分期以及UPDRS分数）方面并无明显差异；因此，GBA基因L444P突变位点在中国大陆汉族PD患者的疾病进展过程中有着重要作用[14]。
国内也有学者对184例PD患者及130例正常人群进行病例对照分析，研究结果中进一步证明所熟知的GBA基因突变与中国人群的PD患病风险是具有相关性的[15]。
2.2.3 R359X突变位点 R359X突变位点是在患有Ⅱ型戈谢病的非犹太PD患者中发现的，且该位点突变在患戈谢病的西班牙裔患者中呈现一种低流行的趋势。然而，有关R359X基因突变的报道并不伴随表现型帕金森病。虽然很难决定患者中哪个突变可能影响了表现型帕金森病的发展，但因在这些患者中都发现了R359X突变，则 R359X基因多态性可能成为帕金森病表现型的病原所在。
3 展望
迄今为止，杂合GBA基因的突变是已确认的帕金森病的遗传危险因素，但并不能完全解释PD的发病原因，且绝大部分的散发性PD患者是由于环境因素诱发或者由环境因素及遗传因素共同作用的结果。从遗传学角度进行PD的病因学研究，将基因多态性与临床表现结合起来，对于寻找PD的发病机制，并针对其发病机制进行早期诊断和鉴别诊断、制定靶向治疗方案，以及对疾病后期评价疗效、判断预后具有十分重要的意义。
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【关键词】 GSTM1；基因多态性；易感性；鼻咽癌
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.03.748 文章编号：1004-7484（2014）-03-1781-02
肿瘤的发展及发生是一个多步骤，多基因的病理过程。它受环境和遗传等多种因素共同影响。环境中的化学致癌物质进入人体后，因人体内代谢酶基因的多态性和表达差异，不同个体形成不同内暴露的剂量，机体基因随之改变，机体细胞分化及细胞增殖受到影响，细胞癌变，最终造成个体患癌易感性的差异。谷胱甘肽转移酶，它参与人体致癌物质的代谢和解毒过程。若GSTM1基因发生突变，则可能影响谷胱甘肽转移酶的活性。因此，GSTM1的多态性和肿瘤的易感性密切相关。NPC在我国南方的发病率比较高。NPC属恶性肿瘤。它的发生及发展与遗传，环境等因素密切相关。吸烟是NPC的重要危险因素[1]。相关研究表明[2]，GSTM1与头颈部癌，膀胱癌，肺癌等密切相关。本文，选取我院2009年2月――2012年2月收治的78例NPC患者作为观察组，另选取78例健康体检者作为对照组，分析GSTM1的多态性与NPC易感性的关系。报道如下。
1 资料及方法
1.1 临床资料 选取我院2009年2月――2012年2月收治的78例NPC患者作为观察组。另选取78例与观察组患者同民族，同性别，同居住地，年龄相近，无血缘关系的正常人群作为对照组。观察组中，男54例，女24例；年龄48-72岁，平均（54.1±10.8）岁；其中，腺癌7例，鳞癌71例。对照组中，男54例，女24例；年龄49-72岁，平均（54.2±10.9）岁。两组一般资料比较，P>0.05，具备可比性。采集两组外周静脉血，均进行EDTA（抗凝）。
1.2 方法
1.2.1 进行流行病学的相关调查 全部调查员均接受统一培训。应用统一的调查表格。调查员逐一与研究对象面谈。具体调查内容如下：职业史，现病史，家族肿瘤史，治疗方法，饮酒史，吸烟史，既往病史，一般情况等。
1.2.2 提取DNA 我们应用苯酚，异戊醇，氯仿及蛋白酶K消化法提取研究对象的DNA。经光度计（紫外分光）定量后，备用。
1.2.3 内对照检测 我们采用DNA热循环仪（型号：PE2400）。应用PRC引物（2对）。其中1对为GSTM1的基因引物，可扩增基因外显子中4的5端至5的3端。包含内含子4在内的273bp的引物[3]。序列的上游为：5-CTGCCCTAGTTGATTGATGGG-3[4]。序列的下游为：5-CTGGATTGTAGCAGATCATGC-3[5]。另1对为内参照引物。它为350bp长的人类白蛋白基因片段。序列上游为：5-GCCCTCTGCTAACAAGTCCTAC-3。序列下游为：5-GCCCTAAAAAGAAAATCGCCAATG-3。反应体系：50μL。包括：34μL的ddH2O，5μL的PRC缓冲液，4μL的dNTPs（2mmoL/L），4μL引物（每种各1μL），1μLDNA模板（20mg）。预变性，然后加入液体石蜡和1U Taq DNA的聚合酶（华美公司）。具体反应条件：95℃预变性10min；然后，变性1min（95℃）；退火1min（55℃）；延伸2min（72℃）；循环35次；延伸8min（72℃）。然后，将反应物置于琼脂糖凝胶板（2%）上，100V，电泳30min。再进行EB染色（10min）。最后，应用透射分析仪（紫色）观察结果。以273bp片段判断GSTM1的基因型。
1.3 统计学处理 应用SPSS19.0统计学软件，应用x2检验，以比值比（OR）及其95%可信限（CI）表示相对危险度。
2 结 果
2.1 两组基因多态性结果比较 观察组GSTM1基因空白基因型概率为65.38%；对照组空白基因型概率为44.87%；与对照组相比，观察组空白基因型概率更高（P=0.01，x2=6.63）。见表1。若将GSTM1基因空白基因型看作暴露因素，OR=1.840，95%CI=1.045-3.146。提示，与非空白基因型个体相比，空白基因型个体患NPC危险性更大，见表1。
2.2 NPC的病理类型和基因型之间的关系 鳞癌患者空白基因型概率为67.61%；腺癌患者空白基因型概率为42.86%；与腺癌患者相比，鳞癌患者空白基因型概率更高（P
2.3 吸烟与基因型的关系 对照组和观察组不吸烟人群中GSTM1基因空白基因型概率比较，差异无显著意义（P>0.05，x2=3.26）。对照组和观察组中吸烟人群中空白基因型概率比较，差异具统计学意义（P
3 讨 论
相关研究表明[6]，90%以上的肿瘤发生与致癌因子有关。人群对致癌因子的反应具有明显差异。肿瘤易感性受肿瘤易感基因的影响。NPC是我国较为常见的恶性肿瘤。广东，广西等地区是NPC的高发区域。NPC的主要危险因素为吸烟。EB病毒是NPC的首要病因。EB病毒分布广泛，感染率较高。癌症往往由多种因素共同作用所致，单纯EB病毒感染，不可能形成NPC高发区。NPC具有显著的遗传易感性及家族聚集性。因此遗传因素和环境因素受到越来越多人的关注。GSTM1基因属于GSTM基因家族。相关研究表明[7]，头颈癌，膀胱癌，肺癌等与吸烟有关的癌症的发生及发展，与GSTM1密切相关。本研究中，通过对比NPC患者与健康人群发现，观察组GSTM1基因空白基因型概率为65.38%；对照组为44.87%；与对照组相比，观察组空白基因型概率更高（P=0.01，x2=6.63）。鳞癌患者空白基因型概率为67.61%；腺癌患者空白基因型概率为42.86%；与腺癌患者相比，鳞癌患者空白基因型概率更高（P0.05，x2=3.26）。对照组和观察组中吸烟人群中空白基因型概率比较差异具统计学意义（P
现今，已有临床证据显示NPC的遗传易感性还可能与CYP2E1基因及HLA基因有关。由此可知，NPC的发生及发展，不仅受GSTM1基因影响，还可能与其他参与解毒过程的基因有关。至于具体关系如何，还有待我们进一步研究阐述。
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[关键词] 肿瘤坏死因子；基因多态性；易感基因
[中图分类号]R73[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）05（c）-004-03
肿瘤坏死因子（TNF）是体内具有多种生物活性的细胞因子，根据其来源不同可分为两种：TNF-α和TNF-β。它们主要是由单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞分泌的细胞因子，可以诱生TNF自身和IL-1、IL－6等其他细胞因子，增加HLA－I、HLA－II类抗原表达，促进B、T细胞增殖和免疫球蛋白的合成，具有广泛的诱导炎症和免疫调节功能。编码TNF-α和TNF-β的基因分别称为TNF-α基因和TNF-β基因，与MHC基因紧密连锁，TNF-α基因和TNF-β基因位于HLA-DR以及HLA-B位点之间的HLA-III抗原基因簇，即6p21.3[1]。
1 TNF基因多态性
TNF－α基因由4个外显子和3个内含子及5'端非翻译区及3'端非翻译区组成，近来研究表明，TNF－α有16个多态性位点，包括5个微卫星、10个复等位基因和一个1C插入位点，其多态性位点已证实的有：－308、－238、＋70和－376位点的GA碱基变化，－863位点CA、－1031位点TC、－857及－850位点CT的碱基变化，其中4个多态性位点在TNF－α基因启动子区域[2]。Wilson等[3]首先报道了TNF－α基因启动子区域内转录起始点上游第308位点的双等位基因多态性，308位点为鸟嘌呤核苷酸G时，定义为TNF1，308位为腺嘌呤核苷酸A时定义为TNF2，TNF1较常见，TNF2较罕见。这一位点的突变造成了限制性内切酶（Nco I）识别位点的缺失，使被A替代的核苷酸序列不能被Nco I识别并切断，即限制性片断长度多态性（RFLP）。另有研究表明，TNF2因能通过增强转录产生更多的TNF－α，故也将其称为TNF－α高产型。Wilson等的研究表明，该多态性位点在白色人种与HLA－DR3 连锁不平衡相关；且－308A等位基因与HLA－DR3、A1、B8单倍型显著相关[4]。但也有学者认为TNF－α基因多态性是独立于HLA之外的一类疾病风险因子，因而其表达产物TNF－α与HLA基因型无关。TNF－β基因多态性位点在第一内含子、转录起始位点下游第252位点（＋252位点）的鸟嘌呤核苷酸G被腺嘌呤核苷酸A替代，这一位点的突变使Nco I识别序列发生了变化，致使被A所替代的核苷酸序列不能被Nco I识别并切断。TNF－β基因多态性还包括：5'非翻译区的一个多态性残基、3'非翻译区的一个EcoR I限制性片断长度多态性、在外显子3'处有一个替换及多个TNF微卫星等位基因[2]。
2TNF基因多态性与有关易感性恶性肿瘤
2.1 消化道恶性肿瘤
TNF－α在肝坏死性炎症、纤维形成、肝细胞癌变的过程中起着重要作用。Suneetha等[5]研究表明，HBV感染后肝损伤严重的患者和肝损伤轻微的患者中，TNF－β等位基因的分布频率有显著区别。严重肝损害患者TNF－β A/A等位基因出现频率要明显高于对照组。而TNF－α－308位点的基因多态性似乎与肝损伤的严重程度不相关。Kim等[6]的研究表明，TNF-α-308A（TNF-α-308 A/G或A/A）或－863位A缺失（TNF-α-863 C/C）变异体与HBV感染的消除有关。TNF-α单倍体1（－1 030T；－863C；－857C；－308G；-238G；－163G）和单倍体2（－1 030C；－863A；－857C；－308G；-238G；－163G）与HBV的清除、保护性抗体的产生相关。目前还未见有文献报道TNF基因的多态性与肝癌的易感性有关，但肝炎后引起的肝损害是肝癌发病的高危因素。Lee等[7]的研究表明， TNF-α－308位点的基因多态性的分布频率在胃癌组与正常对照组中无显著性差异，且和胃癌的组织学类型无相关性。Perri等[8]研究表明，在意大利的两个胃癌的高发地区和低发地区，TNF－α－308位的多态性和基因频率与胃癌无相关性，并且在HP阳性组和阴性组中，TNF－α－308基因的分布频率没有明显的差别。但另有研究表明，TNF－α－308A等位基因与HP感染相关。Ohyama等[9]的研究表明，TNF－α－857基因(C/C,C/T,T/T)的分布频率在胃癌组和正常对照组中无显著差别，TNF－α－857 T/T和HP感染与增生性胃炎相关，TNF－α－857T等位基因可能促进胃癌扩散。Lee等[10]分析了韩国人口中5种TNF－α启动子多态性(-1 031,-863,-857,-308和-238)及2种TNF－β多态性（内含子1和苏氨酸26天门冬酰氨）在胃癌组、十二指肠溃疡组和正常对照组间的不同，发现单独的多态性与胃癌和十二指肠溃疡的发病风险不相关。对7种多态性进行单倍体分析，单倍体型在对照组、胃癌组和/或十二指肠溃疡组间区别不明显，但个体单倍体C和D（在－1031，－863和－857位点上有相反的等位基因）的频率在胃癌组和十二指肠溃疡组间有显著差别，这提示TNF/LTA基因型在胃癌和十二指肠溃疡的发病机制上起完全不同的作用。
2.2 呼吸系统肿瘤
Selfart等[11]研究了117名肺癌患者（包括77名非小细胞肺癌患者和40名小细胞肺癌患者）和131名健康人TNF－α－238和TNF－β－Intron1－252的基因多态性，发现非小细胞肺癌组TNF－α－238和TNF－β－Intron1－252的基因多态性与对照组相比有显著性差异，而小细胞肺癌组与对照组相比则无显著性差异。
2.3血液系统肿瘤
Mainoufowler等[12]报道的54例来自北欧的非霍奇金淋巴瘤LT－α＋252位多态性检测结果表明该位点的等位基因频率与对照组无显著性差异。近来，Chouchane等[13]对124例来自突尼西亚的恶性肿瘤患者进行了研究（其中NHL 44例、乳腺癌40例、其他肿瘤40例），发现恶性肿瘤患者TNF2等位基因频率较正常对照组明显升高，而TNF1基因型则明显降低，提示该纯合型可能是一个抑癌的保护型；相反，携TNF1/2杂合型患者患NHL的危险性增高，这一结果似乎表明TNF的多态性与NHL发生的易感性有关。但Bilkay等[14]却得出了不同的结果，他们调查了273例来自法国的NHL患者，发现TNF－308位合LTα＋252位等位基因频率与对照组相同，提示其多态性与淋巴瘤的发生无关。Demeter等[15]检测了73例CCL的德国患者TNF－308位和LTα＋252位等位基因，发现CLL患者TNF1等位基因频率明显升高，但与疾病进展无关，而LTα＋252位等位基因频率患者组与对照组无显著性差异，但在进展期CLL患者中的该等位基因频率增加，再发生自身免疫性溶血性贫血的CLL患者中，大部分人携有LTα＋252位等位基因。这些研究表明，低水平的TNF－α/LTα与CLL的发生发展有关，与细胞因子自分泌、旁分泌有关的免疫基因在CLL的病情进展中起作用。
2.4 泌尿系统肿瘤
Bilkay等[15]分析了肾细胞癌患者中TNF－α－308 G/A的基因多态现象和等位基因分布频率，结果提示TNF－α－308 G/G基因型可能是保护性因素，但基因多态现象和等位基因分布频率与对照组相比无明显差别。Nakajima等[16]分析了81例来自日本的肾细胞癌患者TNF－α－238、－308、488位点的三个基因多态现象，结果发现在－238和488位点GA的突变和GA基因型在晚期肾细胞癌患者中较常见，－238和488位点的基因多态现象与肾细胞癌病程发展相关。Bong等[17]分析了73例前列腺癌患者TNF－α基因启动子-308位点及488位点基因多态性现象,发现-308位点GA基因型及488位点GA基因型在前列腺癌患者中较为多见,因此推测TNF－α基因-308位点及488位点基因多态性与前列腺癌易感性相关。March等[18]研究了膀胱癌患者中TNF－α 488及-859两个位点的多态性，发现TNF－α 488A和TNF－α-859T与膀胱癌发生密切相关,并且这些基因的多态性与肿瘤分期有关。
2.5其他恶性肿瘤
Smith等[19]研究了144例女性乳腺癌患者TNF－α-308位点的基因多态现象,发现-308位点的GG基因型比其他基因型个体更易患乳腺癌。Sarvestani等[20]研究了233名来自伊朗的女性乳腺癌患者TNF－α-308位点及TNF-β 252位点的基因多态现象,认为这两个位点的基因多态现象与乳腺癌的易感性无相关性。Duarte等[21]研究了195名进展期宫颈癌患者TNF－α-308位点的基因多态现象,发现-308AA基因型在宫颈癌患者中较为常见,然而这并没有统计学意义,这可能和AA基因型在人群中较为罕见有关。Deshpande等[22]研究了宫颈癌患者TNF的11个多态性位点，发现-572、-857、-863位点的基因多态现象与宫颈癌的易感性相关。Skov等[23]研究了TNF－α-308位点的基因多态现象与基底细胞癌的易感性之间的关系,发现基底细胞癌的发生与TNF－α的高水平表达相关,但未发现其易感性与此位点的基因多态现象有关。Pandey等[24]研究了TNF－α基因多态现象与肉瘤的易感性的关系,发现TNF－α-308位点及-238位点的基因多态现象与肉瘤的易感性之间无明显关系。
3 结语
综上所述,TNF基因的多态性与某些恶性肿瘤的发生、发展和预后有关,由于TNF基因的多态性造成TNF转录水平的变化，进而影响TNF的表达,而TNF直接或间接参与肿瘤的发生、发展,因此TNF基因多态性可作为某些肿瘤易感性的遗传标志,随着对TNF基因多态性与肿瘤的易感性等研究的不断深入,必将从基因水平对某些肿瘤的病因、病理生理等方面的认识产生一个新的飞跃。
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【关键词】 阿司匹林抵抗;基因多态性
阿司匹林作为一种有效的抗血小板聚集药物广泛应用于心脑血管疾病的防治，临床观察显示阿司匹林能减少约25%的心脑血管疾病复发。然而，并不是所有患者都能从阿司匹林治疗中获益，有研究显示0.4%～83.3%个体对阿司匹林的抗血小板作用不敏感，即存在阿司匹林抵抗现象(aspirin resistance,ar) [1]。阿司匹林抵抗的确切机制不明，遗传可能为其重要因素，本文将近年ar与基因多态性方面的研究作如下综述。
1 阿司匹林抵抗
1.1 阿司匹林抵抗的定义 bhatt[2]等将阿司匹林抵抗分为临床性及生化性。临床性为患者口服阿司匹林后仍发生缺血性血管疾病;生化性为口服阿司匹林后，未能改变血小板功能试验结果。
1.2 阿司匹林抵抗的分型 有研究[3]将生化性阿司匹林抵抗分为3型：(1)ⅰ型阿司匹林抵抗(药动学型)：口服同样剂量的阿司匹林，体内血栓素(tx)合成和胶原诱导血小板聚集均未被抑制。而体外富血小板血浆中加入100 μmol/l阿司匹林后可被抑制，提示使用小剂量阿司匹林有相当大的药动学差异。(2)ⅱ型阿司匹林抵抗(药效学型)：无论体内及体外，口服阿司匹林后，tx合成和胶原诱导血小板聚集均未被抑制，提示该型阿司匹林抵抗的机制与环氧化酶(cox)的遗传多态性有关。(3)ⅲ型阿司匹林抵抗(假性阿司匹林抵抗)：口服阿司匹林后能抑制tx合成，但不能抑制胶原诱导的血小板聚集。该型患者之所以被冠以“假性抵抗”，因为阿司匹林已抑制了tx合成，而不能抑制其他物质如胶原诱导的血小板聚集。
2 阿司匹林抵抗机制
ar发生的具体机制尚不清楚，可能与药物剂量不足[4]，环氧化酶1(cox1)及血小板糖蛋白(gp)的基因多态性，胶原，吸烟，血脂异常等多种因素有关。血小板活化路径可由血栓素a2(thromboxanea2，txa2)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，adp) 、胶原、凝血酶和糖蛋白(glycoprotein，gp)ⅱb/ⅲa 受体等诱导,而阿司匹林仅能有效地阻断血栓素a2途径。目前，对于血小板活化路径及基因多态性与阿司匹林抵抗的关系研究主要集中在以下几个方面[56]：(1)血栓素激活途径中编码环氧合酶1 (cycloxygenase1 ，cox1) 的基因多态性。(2)gpⅱb/ⅲa激活途径中编码血小板膜gpⅲa的血小板抗原1/血小板抗原2 (platelet antigen1/platelet antigen2，pla1/pla2)多态性。(3)胶原激活途径中编码血小板膜gpⅰa/gpⅱa的807c/t和873g/a多态性。(4)5二磷酸腺苷受体p2y1的基因多态性。这些多态性位点有可能影响阿司匹林的抗血小板作用。现从基因水平分析阿司匹林抵抗的机制。
2.1 环氧合酶基因多态性 cox是前列腺素合成过程中的重要限速酶，它有两种同工酶：cox1和cox2。cox1是花生四烯酸转换为前列腺素g/h途径中的第一个酶，其有两种酶活性，一种环氧化酶活性催化前列腺素g的生成，一种氢过氧化物酶(hox)活性减少前列腺素g，生成前列腺素h，前列腺素h更进一步被cox催化成为前列腺素和血栓素[7]。阿司匹林抗血小板作用机制主要是使cox1丝氨酸530不可逆的乙酰化，从而使该酶失活，阻断了txa2的形成。目前已发现多个cox基因多态性位点[8]，不同cox的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，snps)可影响cox的蛋白结构或构象，使其对阿司匹林抑制作用的敏感性极不均一，构成一些病人ar的结构基础。
maree等[9]将144位冠心病患者按cox1单核苷酸多态性分为五组[a842g，c22t(r8w)，g128a(q41q)，c644a(g213g) 和c714a(l237m)],均给予阿司匹林口服，发现a842g与c50t完全连锁不平衡。携带含有突变体842g等位基因的患者与野生型a842相比，花生四烯酸诱导的血小板激活和血清血栓烷b2 (txb2 ，txa2 的下游产物)产生更明显,提示携带突变体842g等位基因的患者对阿司匹林治疗较不敏感。表明cox1的遗传变异性可以影响花生四烯酸诱导的血小板聚集和血栓形成，病人对阿司匹林的反应部分决定于cox1的基因型。gonzalezconejero等[10]的研究则显示cox1 50t等位基因可能与阿司匹林抵抗有关。
2.2 血小板糖蛋白(gp)ⅱb/ⅲa基因多态性 血小板糖蛋白gpⅱb/ⅲa是细胞黏附受体整合素家族中的一员，含有纤维蛋白、纤维连接蛋白、von willbrand factor(vwf)等黏附蛋白的特异结合位点，参与血小板黏附和聚集。ar可能和血小板膜gpⅱb/ⅲa受体复合物的多态性有关，gpⅱb/ⅲa受体是血小板活化的最后共同通路。编码gpⅱb/ⅲa的基因具有高度的多态性。gpⅱb/ⅲa基因(包括编码gpⅱb和gpⅲa的基因) 突变、缺失或插入导致表型改变，进而引起血小板功能改变。迄今已发现c157t、a1163c、a1553g、t1565c等多个gpⅲa多态性位点，较为常见的是外显子2第1565位氨基酸的突变，即t1565c(leu33pro) ，编码leo的位点称为pla1(hpa1a)，编码pro的位点称为pla2 (hpa1b)。关于gpⅱb基因多态性的研究较少，主要有gpⅱbmax/max +(g2603a，v837m)，hpa3a/3b(t2622g，ile843ser) ，gpⅱbg1063a(glu324lys) 等多态现象，其中研究最为广泛和深入的是gpⅱb残基843位ile/ser的变异，它与人类血小板抗原3 (hpa3) 相关。
大量证据表明，gp受体多态性是动脉血栓形成的遗传危险因素，它能造成黏附受体成分的表达、功能和免疫遗传学的多样性。血小板激动剂(如txa2)通过细胞内信号激活gpⅱb/ⅲa受体，介导纤维蛋白原及其受体结合，然后促进血小板聚集。阿司匹林通过干扰cox非依赖性细胞内信号转导并使gpⅱb和gpⅲa分子乙酰化来抑制gpⅱb/ⅲa的活化。尽管还未完全弄清，但目前所知的cox非依赖性信号转导途径可能包括跨膜蛋白受体、磷脂酶、ca2 +释放、腺苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶和蛋白激酶c等。某些弱的激动剂(如adp、肾上腺素和胶原蛋白)导致的gpⅱb /ⅲa激活可被阿司匹林部分抑制。在pla2基因型存在时,抗血小板作用可以因这种替代途径减少而降低。
agnieszka slowik等[11]研究发现pla2等位基因是男性患者大血管病变所致卒中独立的危险因素。该研究分别选取92例大血管病变所致卒中患者及184例对照者，103例小血管病变所致卒中患者及206例对照者，182例心因性卒中患者及182例对照者。结果显示小血管病变及心因性卒中患者与对照者相比，pla2等位基因出现的频率相似，无统计学意义;而大血管病变所致卒中的男性患者pla2出现频率高(39.7% vs 23.0%;p=0.003 ，or=2.51;ci为1.21～5.20)。grove等[12]检测了1191例健康人和1019例冠心病患者的pla2频率，在这些患者中529例以前有过心肌梗死史。结果健康人中28%为pla2基因型，28%的冠心病患者(除外心肌梗死患者)为pla2基因型，35%的心肌梗死患者为pla2阳性。健康对照与心肌梗死患者之间pla2基因频率有统计学差异。因此，他们认为斯堪的纳维亚人pla2基因型与心肌梗死而不是冠心病的危险增加有关。szczeklik a研究的结果提示与pla1相比，pla2等位基因更倾向于促进血栓的形成从而参与了阿司匹林抵抗的发生。papp e等[13]研究也发现,阿司匹林抵抗患者中pla2等位基因出现的频率要明显高于那些对阿司匹林有良好反应的受试者，而且该研究中所有pla2/a2 基因型患者对阿司匹林的抗血小板反应均不良。这就提示pla2等位基因可能与阿司匹林疗法反应的不充分、不敏感相关。然而，macchi等[14]的研究发现pla1等位基因更容易对小剂量阿司匹林治疗发生抵抗。
2.3 血小板糖蛋白gpⅰa/ⅱa受体基因多态性 gpⅰa/ⅱa (整合素α2β1 )位于连接血小板与胶原纤维(ⅰ、ⅱ型)或非胶原纤维( ⅲ、ⅳ型)的二价阳离子键的中间。在正常个体与那些先天遗传存在α2基因的四个等位基因的个体中,其血小板表面表达的gpia/ⅱa是不同的。gpia基因位于第5号染色体上，对于这一基因的一些相关研究，揭示它的一些有症状或无症状的多态现象，以及由此引起的受体的结构和功能的改变，以及血小板表面的gpⅰa/ⅱa受体多拷贝间的差异。α2gpia多态性—807ct(phe224)和873ga(thr246)已被证实与血小板表面受体不同的表达有关。基因型807tt(873aa)与受体的高密度表达有关，而807cc(873gg)则与低密度表达有关。杂合子则与中间受体表达的水平有关。第三种多态性是由于1648位点上g到a被替换所致，这同时也引起505位点(br系统)上glu/lys被替换。同时，gpia807c/t与glu505 lys之间存在基因相关，且br的多态性与位于核苷酸环化酶837(ct)上的一个稀有多态性相连结，携带等位基因i(807t/873t/873a /brb)者表现出高水平的gpⅰa/ⅱa，而携带等位基因ⅱ(807c /837t/873g/brb)和ⅲ(807c/837c/873g/bra)者则表现出低水平的血小板整合素。胶原是一种重要的血小板聚集诱导剂，血小板胶原受体血小板膜糖蛋白ⅰa/ⅱa密度增加可能是血栓形成的潜在危险因素和阿司匹林抵抗的原因，血小板膜糖蛋白ⅰa/ⅱa基因多态性可以增加血小板膜胶原受体的密度[15]，从而降低阿司匹林疗效。
2.4 adp受体p2y1基因的变化 adp是血小板聚集的重要介质，adp的调节作用是通过与血小板表面g蛋白偶联p2y受体相连接而实现的。迄今为止已有8种p2y受体亚型被克隆，对p2y1和p2y12的研究较清楚。gαq偶联p2y1受体与adp结合，使钙离子释放，改变血小板形状，使血小板聚集。另一种主要的受体p2y12与g蛋白gi偶联,抑制腺苷酸环化酶，活化磷酸肌酸激酶3，活化gpⅱb/ⅲa受体。任何一个受体的抑制均会引起血小板聚集的显著减少。
adp通过p2y1和p2y12受体刺激血小板的激活和聚集，这些受体的突变与止血异常有关，任何一个受体的抑制均会引起血小板聚集的显著减少。阿司匹林以协同方式减少这些情况的发生[16]。p2y12和阿司匹林的复合拮抗作用已在临床上被证实可显著减少血栓事件的发生[17]。因此，adp受体p2y1基因的相应功能变化能够改变adp的信号功能，并且能降低对阿司匹林(包括p2y12抑制剂，如噻氯匹啶和氯吡格雷)的反应性，导致血栓前状态的产生和对阿司匹林的反应性降低。
fontana等[18]在98名健康研究对象中发现了p2y12受体5种多态性，其中4种是完全连锁不平衡。这导致两种单倍体产生，h1 (86%)和h2 (14% ) 。携带h2单倍体的受试者使用较低浓度的adp (2 μm) ，血小板聚集增多。纯合子h1 (h1 /h1)平均聚集率为34. 7% (n= 74) ，有一个h2等位基因(h1 /h2，n= 21)聚集率为67. 9% ，在有2个h2等位基因(h2 /h2，n=3)聚集率高达82. 5%。这提示p2y12多态性在阿司匹林抵抗中可能起作用。近来发现p2y1 受体a1622g多态性与血小板对adp反应不同相关。携带少见的g等位基因对adp反应更强。jefferson等[19]在332例男性有心肌梗死史的患者中研究发现阿司匹林抵抗患者与p2y1基因c893t多态性密切相关。携带杂合子c893t等位基因患者与携带常见纯合子c893等位基因者相比阿司匹林抵抗率高出3倍，机制尚不清楚。
以上综述了近年来关于基因多态性与阿司匹林抵抗关系的研究结果。由于没有国际公认的对阿司匹林抵抗的定义，多数研究样本量较小，研究结果间还存在很多矛盾，迄今为止遗传对阿司匹林抵抗的作用并不确切。所以仍需继续开展大规模和不同种族人群中的前瞻性研究来证实这些基因多态性与ar有关。
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遗传学研究发现惊恐障碍具有家族聚集性，神经生化研究证实中脑皮层的DA能系统与胆囊收缩素受体（CCKB）共存于CNS内，经安定药长期治疗后，中脑DA神经元CCKmRNA的表达量明显升高。本文综述了惊恐障碍相关CCK亚型，CCK及其受体基因多态性近年来进展。
惊恐障碍（panic disorder, PD）是以反复出现显著的心悸，出汗，震颤等植物神经症状，伴以强烈的濒死感或失控感，害怕产生不幸后果的惊恐发作为特征的一种急性焦虑障碍［1］。意外发现低剂量CCK4（Cholecystokinin tetrapeptide）能诱发PD患者发作，而正常人需要较高剂量，提示大脑中广泛分布的CCK神经元及其分布一致CCKB受体可能包含在人类PD的病理生理机制中；由此CKKB受体基因自然成为PD的候选基因；其中惊恐障碍，精神分裂症及焦虑障碍研究较多。
1 CCK前体、CCK与PD
有证据表明PD患病者中CCK神经递质系统发挥着重要作用。人类大脑中CCK分布广泛，在皮质，基底节，杏仁核，下丘脑中含量最高，海马及脑干含量次之，小脑和脊髓含量最低。CCK首先在细胞体合成前体（PreproCCK），其活性片段包括CCK58，CCK39，CCK33，CCK12，CCK8，CCK4等，合成后储存于突触前囊泡，以胞裂外排放方式释放；CNS中CCK8最多，占60～70%，且80%CCK为CCK58的降解产物，大多数CCK产物羧基末端结构相似，第7位上酪氨酸以硫化形式存在以保持与相应受体的亲和力和生物活性。尽管CCK4可诱发PD，而且脑脊液和淋巴细胞CCK浓度较正常对照水平低，没有治疗的PD患者较已经治疗的PD患者，包括抑郁症和精神分裂症有明显增高的淋巴细胞内CCK4介导的细胞内Ca2+动员；但有学者在研究其前体（PreproCCK）基因多态性是没有发现与PD相关联。
2 CCK能神经系统与PD
2.1 CCK受体脑内分布，亚型和功能 研究大鼠发现CCK受体与CCK神经元分布基本一致，大脑皮质，纹状体最多，下丘脑，海马次之，而小脑内几乎没有。根据功能及受体分子克隆将CCKB受体分为CCKA受体及CCKB受体两种亚型，因为前者主要分布于外周组织， 在消化系统主要是通过CCKA而发挥作用；后者则广泛分布于中枢神经组织，后者是精神疾病研究重点，CCKDA共存的神经末梢分布到伏隔核后内侧区，且富含CCKB；推测该区CCK通过激活CCKB受体加强DA的功能，而前区则通过CCK与CCKB受体结合抑制DA的功能，从而调节情绪反应及情感表达。有人研究发现CCK预防谷氨酸所致的神经毒性作用是通过CCKB抑制NMDA引起的NO形成而产生，另外还与吗啡的镇痛作用相关；近年还发现同时CCKB参与肿瘤生长，心血管，呼吸，学习，记忆，睡眠等活动［2］。
2.2 PD相关CCK能系统的实验根据 首先CCK大量存在于同人类情感表达，情绪体验和焦虑有关的脑区边缘系统。其次，CCK常与经典的神经递质系统或多态共存，如：与DA能及YGABA能等神经元共存，前者参与人的行为反应，后者参与苯二氮卓类抗焦虑剂的病理生理作用机制。
多数依据多来自于动物实验（老鼠跑X迷宫），当然在人CCK诱发PD早已众所周知；先应用CCK受体的选择性或非选择性激动剂制作出现焦虑反应的老鼠模型，最后在应用拮抗剂抗焦虑。首先不同的CCK片段对CCKA受体和CCKB受体结合具有选择性，CCKA受体对羧基端第7位上硫化型CCK亲和力高，如：CCK58，CCK33，CCK39，CCK8；而CCKB受体无论对羧基端6位或7位硫化型CCK类多态都有较高亲和力。
常见用于动物试验的CCKA受体选择性激动剂有caerulein,A71378等。选择性拮抗剂：MK329（L364，718）；PD140，548；SR27897；CR1409等；非选择性拮抗剂：proglumide,benzetrip等；CCKB受体非选择性激动剂有五肽胃泌素pentagastrin，选择性拮抗剂：CI998（PD134308）和L365，260；非选择性拮抗剂同CCKA受体相同。
SinghL等研究老鼠X迷宫试验发现静脉注射CCKA受体选择性激动剂caerulein或CCKB受体非选择性激动剂pentagastrin后，可以增加剂量-依赖性大鼠的焦虑水平，而CCKB受体选择性拮抗剂CI998（PD134308）和L365，260对焦虑大鼠有抗焦虑作用，且CI998（PD134308）仅对CCKB受体所致焦虑有拮抗作用［3］。
2.3 PD相关CCKB受体基因多态性 候选基因研究策略仍是近年较为流行的手段，以下作一简述，当然不一致的意见较多。越来越多的动物试验发现焦虑障碍病理生理机制中包含着CCK的调节作用，在临床研究中也进一步证实CCK有诱导惊恐发作的作用，抗焦虑剂能缓解发作；因此推测可能与表达CCK基因变化有关。这驱使了越来越多学者从分子生物学角度研究PD的遗传多态性发病机理。
根据早期发现大脑皮层CCK多肽和CCKmRNA水平降低，Zachrisson等［4］运用原位杂交检测了大脑皮层Brodmann10区编码两种CCKB受体同源体mRNA变异，结果发现大脑皮质外层（ⅡⅢ）编码CCKB受体mRNA碱基序列长度减少51%，而大脑皮质中相应的同源体在外层减少65%，内层减少（ⅣⅥ）62%；由此进一步证明精神分裂症病理生理机制中CCK能神经传递假说。KennedyJL等［5］研究未发现CCK和CCKA受体基因与PD相关，而对CCKB受体进行单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism.SNPS）分析发现位于5′调节区（CT）n微卫星在PD患者中有高度多态性，因此他认为CCKB受体基因变异在PD的神经生物学发生上有重要作用。
Kato等［6］曾检测了CCKB受体基因的两个突变（2491C/A，位于45外显子之间一个内含子多态性；1550G/A，Val125ILe,位于细胞外第二外显子箕形纹一个反义突变）结果没有发现此突变在PD患者有病理生理意义。YamadaCK［7］运用单链构象多态性对PD的4个已证实CCKBR基因的多态位点研究，其中包括两个新的碱基置换突变位点（3263G/C，3264A/G）没有发现与PD有相关性。Hamilton SP［8］研究编码CCK和CCKB受体基因多态性，运用PCR和荧光偏振探测仪分别检测CCKB受体的多态微卫星遗传标记以及CCK启动区的SNP，连锁分析两者均没有显著性，运用传递不平衡TDT(transmissiondisequilibriumtest)和单体相对风险HRR（halotyprelativerisk）进行统计学分析同样没有相关性。
因为CCK4可以诱发人类惊恐发作，而CCK8则对精神分裂症有治疗作用；日本学者HattoriE［9］研究了编码CCK基因上游区域一个新的微卫星多态性发现与PD显著相关，同时检测主要位于CNS中的CCKB受体基因5′调节区二核苷酸重复序列（CG）n（之前有人曾经报道与PD关联），没有发现在日本人群中与PD及精神分裂症相关。
也有学者［10］研究了特发性环境耐受差（idiopathicenvironmentalintolerance(IEI)）与PD关系发现，人格特质或两者有共同的神经遗传学基础，并能够预测焦虑症状；他们选取11例年龄性别种族背景相匹配IEI症状者为研究对象，检测PD相关CCKB受体基因多态性及人格特质相关的多巴胺D4受体（DRD4）基因多态性；结果显示受体相关的CCKBR等位基因7有较高的患病率，编码DRD4与人格特质相关基因多态性没有显著性差异。因此他们认为在预测IEI相关症状方面，只能说明该结果为两者有共同的神经遗传学基础提供的证据不足，但此结果至少为提示PD者症状与部分IEI者相重叠，并为合理化治疗提供了必要手段。该研究样本量较少，如果扩大样本仍能够重复这一结果则表明伴有IEI者较高的PD患病率，且可能反映是焦虑相关的一种特质；这种特质有利于精神卫生工作者及其心理咨询师有针对性制定治疗方案及其心理干预措施。
3 结语
总之，近二十年研究已经能够合成外源性CCK4，并发现其诱发健康人和焦虑障碍属剂量依赖性，且PD患者更加敏感，甚至低剂量就能够诱发惊恐发作。但内源性CCK是如何诱发PD仍然不得而知，到底是否存在内源性CCK，PD仅仅通过CCKBR作用吗？PD的病因学发生或临床诊断是否可以应用测量脑脊液CCK含量实现，以便可以对此类患者提供更好的诊断和治疗，其实PD的病因学非常复杂，以上问题还远远没有得到解决。
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