关键词：案例教学法；医学微生物学；教学；应用效果
医学微生物学教学中以往日常教学中多采取传统的讲授式教学法授课，主要为老师课堂教授，老师按照教材讲解不同微生物的种类、结构形态、遗传变异等，忽视了将微生物学理论知识与实践的联系，学生对抽象内容难以理解，知识以死记硬背居多，无法深入理解，导致理论知识难以与实际问题相联系[1]。而我们教学的目的是为了社会培养专业的医学人才，因此选择合理的教学方法尤为重要，长期以来，众多学者为改善医学微生物学教学效果进行了许多尝试，其中近年来案例教学法在临床其他课程的教学工作中得到了广泛的推广[2]。案例教学法是老师根据教材中的某一个章节或者多个章节的理论知识为基础，科学合理的选择现实中代表性的实际案例，在理论知识教学的同时引导学生分析、讨论实际案例，并提出各自的见解，老师再给予点评，以此锻炼学生理论与实际相联系的能力，提高分析、解决实际问题的能力[3]。本研究采取对比研究的方法，研究分析了案例教学法在医学微生物学教学中的应用效果。取得了满意的成效，现汇报如下。
1资料与方法
1.1研究对象。研究对象为本校2016届医学检验技术专业1班48名、2班46名学生，所有学生为随机分班，医学微生物学教学课时及带教老师均完全相同。将1班设为对照组，其中男21名，女27名，年龄17～19岁，平均年龄（18.3±0.4）岁，采取传统的教学法授课；2班设为观察组，其中男19名，女27名，年龄17～20岁，平均年龄（18.1±0.5）岁，采取案例教学法授课。两组学生在年龄、性别组成等一般资料方面比较差异无统计学意义，具有可比性。1.2研究方法。1.2.1对照组采取传统的讲授教学法理论知识教学时授课老师首先依据大纲的要求制定计划授课，借助幻灯片和黑板板书进行理论讲解。微生物学实验操作的教学时，授课老师依次讲解微生物学实验的目的、要求、操作方法等，随后再具体指导操作。1.2.2观察组采取案例教学法老师依次按照选择案例、合理设计问题、组织学生分析讨论问题、老师总结分析的思路教学，具体如下：①案例设计：老师根据不同章节的具体内容选择具有代表性、典型性的案例，案例来源可来自于医院的病案室、报刊、学术资料、互联网等多种途径，案例难度应该由易到难，与章节知识密切相关，具有可讨论性，利于学生将知识融会贯通，锻炼学生的思维能力。如在讲解流感病毒的内容时，可从医院病案室选择一例典型的甲型流感案例，完整的讲解案例的症状、实验室检查、治疗、预防，仅需一个案例就可以将医学微生物学基础知识与临床案例结合，帮助学生理解流感病毒的形态、性状、致病性、预防、诊断等知识[4]；②提出问题：可根据所设计的案例，设计与医学微生物学基础知识关联紧密的问题，老师根据大纲要求，尤其对要求重点掌握的难点提出问题，如：抗体的类型和致病的特点、引起食物中毒的病原体有哪些、引起肝炎的病毒的类型和结构特点等，也可举实际案例，如讲解破伤风杆菌时可举实际案例，一患者临床表现为苦笑面容、牙关紧闭、角弓反张，提出此类患者应该如何处理，是注射破伤风抗毒素还是类毒素？在注射破伤风类毒素时有哪些注意事项？通过实际案例及问题可帮助学生详细了解破伤风杆菌[5]；③老师将学生随机分为5组，每组8～10人，组员根据案例及老师提出的问题，结合教材、图书馆、数据库等途径查阅资料，相互分析、讨论、总结答案，再由组长进行回答；④老师分析总结：老师耐心记录各组答案，尤其注意共性问题，最后进行总结点评，对各组答案中的优点给予充分的肯定和表扬，对答案中出现的共性问题即典型性问题重点解答，加强学生对重点和难点知识的掌握程度。同时注重培养和锻炼学生动手实践能力，充分将理论知识与实践相结合。1.3评价指标。待学期结束时通过理论及实训操作考试评价两种教学方法的教学效果，并以调查问卷的形式对案例教学法进行总结分析。1.4统计学方法。采用SPSS21.0软件进行统计学处理。计量资料采用“x±s”表示,组间比较采用t检验,计数资料以率（%）表示,采用c2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组学生成绩比较。观察组学生理论考试平均成绩、实训操作考试平均成绩均显著高于对照组，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。2.2问卷调查结果。在观察组学生中共发放46份调查问卷表，回收46份，回收率100%，调查问卷的结果表明观察组学生学习积极性及主动性、理论知识联系实际问题的能力、言语表达及团队合作沟通的能力、研究分析和解决问题的能力均得到了显著提高，见表2。
3讨论
医学微生物学是临床基础学科中的一门基础课程，与医学专业课程、临床检验工作紧密相关，是医学院校一门主要课程，是感染性疾病的预防、诊治、药敏实验、病原菌分析等的依据[6]。但是由于医学微生物学内容繁杂、专业名词多、枯燥、理论知识抽象等诸多原因导致学生学习积极性不高，学习效果不理想[7]。以往传统的讲授教学法以老师为主、学生为辅，学生学习积极性不高，学习效果差。而案例教学法学生为主体、教师进行辅导，通过实际案例提出问题、引导学生分析、讨论案例、解决问题、纠正错误。将实际案例引入到医学微生物学的教学中大大激发了学生学习的积极性，培养学生的学习能力，通过实际案例将枯燥的理论知识具体化、形象化，增强理论知识联系实际问题的能力[8]。本研究中观察组学生理论考试平均成绩、实训操作考试平均成绩均显著高于对照组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。
综上所述，医学微生物学教学中实施案例教学法，合理设计案例，提出问题、讨论、解决问题，可以激发学生学习的积极性及主动性，提高了学生分析及解决问题的能力，值得在教学中推广应用。
作者:张艳平 单位:常德职业技术学院
参考文献
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【关键词】有机污染物微生物处理基因代谢
中图分类号：Q93 文献标识码：A 文章编号：
一、引言
环境中存在一些滞留时间长、难于直接降解的有机污染物，其中有一些污染物毒性高，具致畸、致突变、致癌及生殖毒性，对人类健康造成威胁的物质。随着有机化合物使用量增大，在很多自然水体中都可以检测到，而且远远超过联合国环境规划署规定的安全浓度，造成严重的环境污染，采用生物降解手段来处理这些污染物成为国内外的研究热点。
微生物对广泛分布在自然界中的有机污染物具有降解作用，已经发现许多微生物对有毒、难降解的有机化合物具有生物降解能力，使得被污染的环境得到修复。微生物修复技术由于成本低、效果好、对环境负面影响小且无二次污染等优点，受到广泛关注。因此，利用生物界中存在的有净化能力的微生物进行生物治理，已成为环境治理的主要手段之一。
国内外许多学者致力于研究如何利用微生物处理技术来提高有机污染物的降解效率，本文综述了近年来微生物处理有机污染物等方面的研究进展，并对其研究方向进行了概述。
二、有机污染物的微生物处理研究进展
1、利用有效菌种降解有机污染物
通过从污染现场的分离，目前已经得到不少能够降解有机污染物的特殊菌种。如广州科研所研制出了具有广谱脱色能力和降解苯胺能力的希瓦氏菌；中科院兰州化物所从土壤中筛选出的“帕氏氢噬胞菌LHJ38”和“类黄氢噬胞菌LHJ39”，对芳香烃类化合物有较强的降解作用。任华峰等人从活性污泥中分离出一株降解对氯苯胺的细菌PCA039菌株，该菌株能够以对氯苯胺为唯一碳源与氮源生长。美国研究人员发现一种叫G4的细菌，对高浓度的三氯乙烯(TCE)有分解能力。日本研究人员也获得一种叫M菌的菌株具有类似的降解TCE的效力。在美国，还获得耐抗生素的拟球菌195菌株，能专一地使高氯乙烯(如四氯乙烯)完全转化为无害的乙烯。
2、基因工程菌在生物降解中的应用
基因工程技术作为生物降解处理有机污染物研究的前沿领域，能够提高微生物的降解速率，拓宽底物的专一性范围，维持低浓度下的代谢活性，改善有机污染物降解过程中的生物催化稳定性等。因此从环境中筛选分离出的菌种，经过基因工程手段改造后能够成为具有特殊降解功能的超级工程菌。
石油污染在中国乃至世界是一个很大的危害，所以急需寻找能够降解石油污染物的工程菌。Chakrab-arty等人在20世纪70年代首先构建成功了具有多种降解功能的细菌菌株。他们将假单胞菌中不同菌株的CAM、OCT、SAL、NAH四种降解性质粒接合转移至1个菌株中，构建成1株能同时降解芳香烃、多环芳烃、菇烃和脂肪烃的“超级细菌”。该菌能将天然菌要花一年以上才能消除的浮油缩短为几个小时，取得了美国的专利权，在污染治理工程菌的构建上，这是第一块里程碑。
崔中利等分离到一株假单胞菌(Pseudomormssp)P3，该菌能够以对硝基苯酚为唯一碳源和氮源进行生长，P3有比较广泛的底物适应性，对多种芳香族化合物都有降解能力，以P3为受体菌，通过接合转移的手段将甲基对硫磷水解醇基因mpd克隆至P3菌中，获得了具有甲基对硫磷水解酶活性的基因工程菌PM，PM能够以甲基对硫磷为唯一碳源进行生长，具有较高的甲基对硫磷降解活性及稳定性。多环芳烃萘可采用现场活体转基因微生物进行修复。Sayler等利用经过萘降解质粒PUTK21修饰的Pseudomonas fluorescens菌株HK44对萘进行降解，其中降解质粒经过了lux基因诱变。该转基因微生物对萘的降解分为两步，首先是使萘转化为水杨酸盐，然后氧化水杨酸盐使其成为乙醛和丙酮酸盐。当该转基因微生物暴露于萘或其代谢中间产物时，该生物体就会发光，我们就可以通过光学和光子计算模型对其进行在线监测。
3、代谢工程在生物降解中的应用
通过代谢工程手段可以把不同宿主细胞来源的代谢组件组装到一个宿主细胞中，从而达到创造新的代谢途径，扩大宿主底物利用范围，使宿主对某些环境污染物部分降解为彻底矿化等目的，防止生成难以降解的终端产物或有毒的中间产物而对环境造成二次污染。
如恶臭假单胞菌P・prtida mt22虽然具有降解广泛底物的甲苯途径，但它不能直接利用苯作为底物，这限制了对石油污染物的降解。Lee等人克隆了编码甲苯还原酶的基因todClC2BA，并将重组质粒导入P・prtida mt22中，使重组菌株可以彻底降解苯、甲苯和二甲苯。
Walker等将有机磷水解酶基因opd和来自Pseudomonas sp・ENV2030的对硝基苯酚降解酶基因转入Pseudomonas putida中得到能以对硫磷作为唯一碳源和能源生长的工程菌，为该类污染物的降解提出了新的方法。
2-氯甲苯(2-chlorotoluene)也是一类较难降解的氯代芳香族化合物。Haro MA等对2-氯甲苯的代谢降解途径进行了深入的研究，并构建了可以降解2-氯甲苯的假单胞工程菌。组合的途径包括：从菌株Pseudomonas putida F1的TOD系统获得一个编码甲苯双加氧酶基因(todC1C2BA)的片段，可以将2-氯甲苯转化为2-氯苯甲醛；另一个片段来自Pseudomonas putida mt-2菌株的PWW0质粒，编码整个TOL途径，表达的苯甲醇脱氢酶(由xylB编码)和苯甲醛脱氢酶(由xylC编码)可以将2-氯苯甲醇转化为2-氯苯甲酸。将上述的TOL和TOD片段组合到单个的mini-Tn5转座子，再将此转座子整合到2-氯苯甲酸降解菌Pseudomonas aeruginosa PA142和Pseudomonas aeruginosa JB2的染色体上，然后通过实验，证明的确可以将2-氯甲苯矿化，同时证明，PA142和JB2都不能将2-氯甲苯作为唯一的碳源。
三、微生物处理技术研究的主要方向
1、寻求能够降解有机污染物的高效的多功能菌种
前面已经介绍了大量的国内外关于这方面的报道。但是这些已发现的自然菌种或者已经构成的工程菌大部分都是专一性菌种，寻找降解性更强的多功能降解菌群仍是研究的主要任务之一。
2、提高有机污染物的可利用性
大部分有机污染物的辛醇水分配系数都很高，尤其是污泥中的有机污染物，因为它们都是经过水处理以后富集在污泥当中的。这些污染物吸附在污泥上，难以与微生物接触，由此导致有机物的可利用性降低。为了提高有机物的可利用性，这方面的工作主要集中在对疏散和解吸污染物非常有效的表面活性剂上。TiehmA等人用两种聚乙烯烷基苯基醚非离子表面活性剂研究了多环芳香烃的生物可利用性。结果表明，由于表面活性剂增强了多环芳香烃的活性而加快了PAHs的降解，所有的实例中均发现了土壤污染毒性的降低。房敏等人研究多环芳烃的降解性时添加了非离子表面活性剂吐温80，发现吐温80的添加对蒽和芘的生物降解率有着显著的作用，分别是不加表面活性剂对照处理的1.5倍和2.5倍。
3、探明高效降解菌株的代谢动力学和代谢机理
目前对于微生物降解有机污染物的代谢动力学和代谢机理的报道还不太多，尤其是关于共代谢的机理，到目前也没有形成统一的解释。Foster认为微生物不能在某种基质上生长的原因，并不是因为微生物不能分解代谢该物质，而是由于微生物本身缺乏吸收、同化其氧化产物的能力。Hughes提出卤代芳烃化合物的共代谢是由于微生物无法从苯环上脱去卤素取代基，并把芳香环基质导向碳吸收同化的节点。Tranter和Cain把具有氧化代谢卤代芳烃化合物功能的细菌不能在该基质上生长的原因归结于中间产物的抑制。但目前提出的各种假设都不能圆满的解释实际工程中所发生的各种共代谢现象，而且不同的生长基质培养出的细菌的驯化能力是不一样的。对于机理的研究一般包括阐明共代谢底物的反馈机制、传递效率、氧气供应等。王建龙等人对具有高效脱氯能力的微生物群落的生理特性进行了研究，结果表明，该微生物群落可以利用丙酮酸为碳源和能源，丙酮酸发酵、硫酸盐还原和脱氯反应三个过程严格的按顺序依次进行，并且丙酮酸浓度在最初2天内急剧下降，同时有代谢产物乙酸、甲酸和氢气形成。只有当硫酸盐被还原成硫化物后，脱氯反应才会发生，硫酸盐和钼酸盐的存在会强烈抑制微生物的脱氯活性。溴乙烷磺酸酯可以完全抑制微生物的产甲烷活性。
总结
科学技术的发展扩大了环境微生物研究的广度和深度，这些技术的发展必然提高人们对降解性微生物的整体和系统的认识，使得这项研究更具目标性和可控性，为更有效地治理难降解污染物提供坚实的理论和技术支持。
参考文献
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【关键词】 三唑； 抗菌； 抗真菌； 抗结核； 抗病毒
ABSTRACT The advances of triazole compounds used as antimicrobial drugs are reviewed， including the research status of triazoles as antifungal， antibacterial， antituberculotic， antiviral agents and so on. As a significant pharmacophore， triazole nucleus appears persified pharmacological activities in various types of antimicrobial agents and it is expected that new triazoles with potentially biological activity will be developed.
KEY WORDS Triazole; Antibacterial; Antifungal; Antituberculotic; Antiviral
三唑是含有三个氮原子的杂环化合物，其药效团呈现出多种生物活性，如抗真菌、抗菌、抗结核、抗病毒等。含三唑的化合物已成为近几年来药物研究与开发的热点和重点领域之一。目前已有众多的含三唑的抗微生物药物用于临床，发挥着各种各样的作用。近年已有文献综述了含三唑的化合物抗真菌研究的情况［1～3］，但迄今为止国内外尚没有专门报道含三唑的药物在整个微生物领域的研发概况。本文介绍含三唑的化合物在抗微生物领域的研究与开发近况。
1 含三唑的抗真菌剂
真菌感染是一类常见病和多发症。近年来，由于肿瘤、糖尿病、艾滋病等消耗性疾病发病率的上升和器官移植手术，再加上广谱抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤药等在临床上的大量使用，患者免疫力降低，致使真菌感染尤其是深部真菌感染发病率大幅度上升，死亡率增加。目前，在各类抗真菌药中，含咪唑、三唑等唑类的药物应用最为广泛，研究最多，已成为抗真菌药研究开发的热点和重点之一。特别是含三唑的化合物，由于药效和毒性明显优于咪唑而备受青睐。
一般认为，含三唑的抗真菌药是真菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶(P450l4DM)抑制剂，通过三唑环上的4位氮原子与P45014DM血红素辅基亚铁离子相络合，阻断了底物羟化反应，结果使真菌麦角甾醇缺乏，羊毛甾醇积聚，膜通透性增加，胞内重要物质外漏，达到抑菌或杀菌作用。
1983年含三唑的抗真菌药特康唑(terconazole，1)的问市引起了对含三唑化合物研发的极大兴趣。随后不久，伊曲康唑(itraconazole，2a)和氟康唑(fluconazole，3)在1988年相继应用于临床。尤其是氟康唑用于临床以来，因其具有广谱高效、不良反应相对较小、
可口服用药等特点引起了抗真菌药物革命性的变化。
目前正在研究开发的含三唑的化合物除少数新型结构外，可分为伊曲康唑类似物和氟康唑类似物。
1.1 伊曲康唑类似物
1988年上市的伊曲康唑2a可看作是特康唑1的类似物，即在其结构上引入芳基三唑酮。伊曲康唑对真菌麦角甾醇的代谢具有高度特异性，使用剂量高也不干扰哺乳动物的药物代谢酶，不抑制依赖细胞色素P450的内源性物质如类固醇激素的生物合成途径。由于伊曲康唑的优越性，许多工作对其进行结构改造和优化，研究开发了一系列伊曲康唑类似物，其中一些衍生物已经上市或处于临床研究中(表1)。
1.2 氟康唑类似物
1988年氟康唑的上市，使真菌病的治疗发生了根本性的变化。由于其高效低毒，浅部与深部兼效，是抗真菌药物的一个重大突破。氟康唑现已广泛用于真菌感染的治疗，并被WHO推荐为深部真菌感染首选用药。但是随着十余年的广泛使用，耐药性越来越严重，因此各国都在不断寻找新的抗真菌药。在众多的研究中，大多数工作都是基于氟康唑的结构进行改造和优化，开发了一系列氟康唑类似物。按结构分为双三唑醇和单三唑醇类似物。
(1)双三唑醇类似物 此类工作保留了氟康唑的整体框架结构，如二个三唑环、醇羟基和2，4-二氟苯基等，仅仅在氟康唑的结构中引入新基团。一是利用氟康唑的醇羟基形成酯类前药，目前报道的有羧酸酯类和磷酸酯类。2003年上市的磷氟康唑(fosfluconazole)4a，是氟康唑的磷酸酯前药，与氟康唑相比水溶性增加，抗真菌活性强，安全性好。进一步在4a的磷酸上引入糖，得化合物4b，可增加其对作用部位的选择性，增强抗真菌作用［5］。二是利用三唑环上氮原子成季铵盐，可增加其水溶性，如化合物5a［6］。葡萄糖含多个羟基、水溶性大，我们利用天然葡萄糖的这些特点，合成了一系列季铵化的新型水溶性糖氟康唑5b，其抗真菌活性与氟康唑无显著性差异［7］。以上这些工作主要集中在氟康唑的前药研究。
在三唑环的3-位碳上引入苯乙烯衍生物所得到的氟康唑双三唑醇类似物6(D-0870)，体内外试验研究表明，对氟康唑耐受的白念珠菌有效，且对睾酮合成无影响，正在进行临床试验。
(2)单三唑醇类似物 此类研究保留了氟康唑的一个三唑环和醇羟基。其中，大多数研究是通过替换氟康唑中的一个三唑甲基得到的，如伏立康唑(7a)，目前已经用于临床。与此同时，对2，4-二氟苯基和三唑甲基进行修饰得一系列衍生物如化合物8和维布纳唑(vibunazole)9，后者可用于念珠菌病的治疗，活性强于酮康唑，口服血浆半衰期t1/2为4.8h。相关情况见表2。
1.3 其它
以上含三唑的化合物均是三唑环1-位氮取代衍生物。许多研究表明，三唑环上多取代也具有抗真菌活表1 已经上市及正在研究开发的伊曲康唑类抗真菌药及其类似物（略 ）性。含1，3，5-位三取代的硫醚三唑的化合物10对白念珠菌和对唑类药物耐药的真菌有抑制活性(MIC=25～50μg/ml)，且活性优于氟康唑和伊曲康唑［12］。构效关系表明，在含3-巯基和4-氨基三唑的化合物11中，保持杂环和芳环之间的电子密度平衡是必要的，且三唑环上氨基和硫醇未取代抗真菌活性更强，用苄基取代对氯苯基活性也较好［13］。
对奥昔康唑进行结构修饰，用三唑环替代咪唑环后得化合物12，体外活性显示对白念珠菌、酵母、黑色
曲霉有强效抑制作用，对酵母的抑制活性强于氟康唑［14］。
上述具有抗真菌活性的化合物都是含1，2，4-三唑的衍生物。含1，2，3-三唑的衍生物也同样具有抗真菌活性，如化合物13对白念珠菌的MIC≤0.125mg/ml，是氟康唑的4倍以上，与伊曲康唑相当，对红色毛癣菌和羊毛样小孢子菌也有较好的抑菌效果［15］。
2 含三唑的抗菌剂
许多研究表明，将三唑环引入到其它抗菌药物中，可降低耐药性，获得具有更强抗菌活性的新化合物。
近年来细菌耐药性大幅度增加，呼吸道感染最主要的致病菌链球菌有将近40%对青霉素和大环内酯耐药。最近发现在酮内酯结构中引入三唑环可以显著降低耐药性，增强抗菌活性。化合物14能显著抑制肺炎链球菌和化脓性链球菌，且最低抑菌浓度(MIC)小于2μg/ml［16］。
将新型广谱抗菌药口恶唑烷酮类药物利奈唑胺(linezolid)中乙酰氨基用三唑环替换得到化合物15(PH-027)，具有显著的抗菌活性，能有效抑制敏感和耐药的革兰阳性菌，包括耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、对甲氧西林敏感的金葡菌(MSSA)、对甲氧西林敏感的凝固酶阴性葡萄球菌(MSCNS)、耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)和肠球菌，其活性优于或相当于利奈唑胺和万古霉素［17］。
用硝基咪唑构筑的含1，2，4-三唑的化合物可以强效抑制需氧菌。含4-硝基咪唑的化合物16可强效表2 已经上市及正在研究开发的氟康唑单三唑类似物（略 ） 抑制大肠埃希菌B，其抗菌活性强于氯霉素。体外抑菌活性的MIC值为62.5～500μg/ml。若用苯并咪唑取代咪唑环，也具有抗菌活性，MIC值为125～500μg/ml［18］。一些含硫的1，2，4-三唑的化合物表现出较强的抗菌活性，如三唑巯醇17及其衍生物18，具有显著的抗菌活性［19］。噻吩三唑19，能够抑制金葡菌、肺炎链球菌和大肠埃希菌，但是抑菌圈直径略小于链霉素［20］。
一些有机锡也是一类新型的具有抗菌活性的化合物。研究表明，在其结构中引入三唑环，具有重要的药理学研究价值。含三唑的有机锡化合物20不仅抑制杆菌活性较强，而且可中等强度的抑制草生欧文菌［21］。
此外，一些含三唑并杂环的化合物也具有较好的抗菌活性。
3 含三唑的抗结核剂
近几年来，具有多重耐药性的结核杆菌不断出现，迫切需要研制新的抗结核药物。在对传统抗结核药物进行结构改造时，引入三唑环可以增加化合物的抗菌作用。目前，含三唑的衍生物主要通过选择性地抑制抗结核药物的新作用靶点结核分枝杆菌14α-甲基化酶(CYP51)而发挥抗结核效果。
近期的研究表明，含硫的1，2，4-三唑化合物能有效抑制结核分枝杆菌H37Rv，具有抗结核活性，如硫醚三唑21(MIC=125～1000μmol/L)。构效关系研究得出，在21中用萘基取代苯基，可增强抑制活性，引入吡啶基则降低活性［22］。含三唑的化合物22中引入硫脲，可增强抗结核活性，22a和22b的MIC分别为32和64μg/ml［23］。
含吡嗪和三唑的化合物也具有较强的抑制结核分枝杆菌的活性，且在三唑环的3位取代抗结核作用最强，如化合物23的MIC为125～500μg/ml［24］。
此外，对于含1，2，3-三唑的衍生物研究虽然较少，但也具有抑制结核分枝杆菌的活性。
4 含三唑的抗病毒剂
传统的核苷类衍生物具有强的抗病毒活性，主要通过与病毒细胞DNA或RNA的5′-三磷酸根相互作用，改变DNA或RNA聚合酶的活性，发挥抗病毒作用。病毒唑(ribavirin，24a)是目前用于抗病毒的含三唑的药物，是1970年合成的嘌呤核苷类衍生物。病毒唑对靶点酶的选择性较低，且容易被水解，将病毒唑磷酸化后，可以使其不易水解，增加了其抗病毒活性。如病毒唑的二磷酸酯衍生物(24b，IC50=180μmol/L)和三磷酸酯衍生物(24c，IC50=40mmol/L)，其活性强于病毒唑(IC50>500mmol/L)［25］。目前对病毒唑的其它衍生物也有研究，但均无显著抗病毒活性，如其己糖醇衍生物。
病毒唑的类似物25也具有强的抗病毒活性，能够显著抑制牛痘苗病毒，其EC50为0.4μmol/L，选择性指数SI>750，中等强度的抑制牛痘病毒(EC50=39μmol/L，SI>7.7)和剧烈的急性呼吸综合征(SARSCoV)(EC50=47μmol/L，SI>2.1)［26］。用S替代O后核苷26，可增加抗病毒活性，可以减小病毒诱导的细胞病变性，且无细胞毒性［27］。苯并三唑替代三唑后的类似物27可作为一些黄病毒科的病毒核苷磷酸化酶和解旋酶抑制剂，抑制丙型肝炎病毒(HCV)、西尼罗病毒(MNV)、登革热病毒(DENV)和乙型脑炎病毒(JEV)。苯并三唑的N-烷基化可以显著增强抑制活性，选择性的抑制核苷磷酸化酶和解旋酶的活性，降低细胞毒性［28］。
非核苷类含三唑的化合物maraviroc(UK-427857，
28)是第一个进入Ⅲ期临床的新型免疫缺陷病毒(HIV)复合受体CCR5抑制剂，具有强效抑制艾滋病病毒活性［29］。S-1360(29)是第一个艾滋病病毒整合酶抑制剂，目前进入Ⅱ期临床试验。整合酶、逆转录酶和蛋白酶是艾滋病病毒感染细胞并进行复制所必需的3种酶，现存的所有抗艾滋病药物都是破坏逆转录酶或蛋白酶功能的。因此，S-1360与其它药物联合可以更好地控制艾滋病病毒在人体中的复制，完善艾滋病的治疗［30］。
5 结语
含三唑的化合物在抗微生物领域的研究工作较多，目前已经涉及到抗真菌、抗菌、抗结核、抗病毒领域，尤其是在抗真菌方面，发展尤为迅速，在短短近20年内就已经有多个含三唑的抗真菌药用于临床。由于含三唑的化合物广泛的生物活性，已有众多的含三唑的抗微生物药物用于临床，发挥各种各样的治疗作用，而且其结构相对简单，合成较易，具有很大的发展潜力，这些都极大地鼓舞着研究者们投身于含三唑的药物的研究与开发。可以预见，在不远的将来，含三唑的化合物作为抗微生物药物的研究与开发将日益活跃，一个新的研究热点即将兴起，会有越来越多的含三唑的抗微生物药物用于临床，以更好的满足人们健康的需要。
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关键词：丙三醇；微生物；进展
丙三醇就是我们经常说的甘油，是多羟基醇的一种，广泛的用在化工以及树脂化工中，同时在药品、化妆品、烟、牙膏以及食品中也有普遍的使用。在最开始制造丙三醇主要使用油脂以及水解，在上世纪四十年代经济发达的国家已经使用化学合成的方式制造丙三醇，经济欠发达的地区依旧使用肥皂制造丙三醇，这两种制造方式生产的丙三醇占市场中丙三醇总量的百分之九十以上。不过伴随着国内洗涤剂的广泛推广，使用肥皂生产的丙三醇产量下降，在国内很长一段时间内出现丙三醇供不应求的现象，探索微生物制造丙三醇是一种必然的结果。使用微生物制造的丙三醇具有极高的安全性，类似于绿色物品，伴随着国内消费构造的改变能够预测到这类丙三醇在市场中的挑战优势很显著，并且在经济欠发达的国家提供微生物制造丙三醇的原料价格低廉，能够从酿酒酵母中抑或耐渗透压酵母中选择其一制造丙三醇，在热带海域干旱位置使用藻类制造丙三醇只需要借助二氧化碳以及阳光即可，因此在本世纪伴随着原始制造丙三醇原料的缺乏以及生物科技的前进，运用微生物方式制造丙三醇具有更加显著的优势。现在已经有很多使用微生物制造丙三醇的研究报告。不过微生物制造丙三醇的开发大多是在试验室内开展的，微生物制造丙三醇进入工业领域以及化学领域的商品挑战从探索的发展程度看，伴随着制造技术的提升，造价的减少以及商品品质的提升所以它的潜能是很大的，在国内首先出现的是发酵方式制造丙三醇。下文中讲述了从材料、制造体系、提取以及制造潜能这些方面对微生物制造丙三醇展开了详细的说明。
1 微生物丙三醇的生产
1.1 微生物丙三醇生产的原料
石油存储量的干涸，进而转变方式，从生物技术方面获取居民生存生活能源的关键方法。用于制造丙三醇的酵母以及细菌能够使用可再生的低价糖蜜和粗淀粉制造。主要在木薯干片、玉米以及木薯淀粉中提取粗淀粉，这些作物在国内种植量大。在国内南方区域内主要使用木薯干片发酵制作丙三醇，主要是因为这种作物需要花费的成本不高，只要把其碾碎，再浸泡，酶法水解再过滤就能够成为制作丙三醇的物料，经实验证实制糖效果不如木薯干片的成果好。在国内北方地区，可以使用种植量最多的玉米作为物料，在玉米淀粉中适当加入别的营养就能够生产出同样的丙三醇，所获取的经济以及社会利益效果是一样的。
除此之外，在沿海抑或干旱的区域内使用培养藻类制造丙三醇比较合适，藻类培养使用的制造原理海水以及二氧化碳大多不需要成本，藻类培养还能够一起制造出丙三醇、动物饲料以及胡萝卜素等。
1.2 微生物丙三醇的生产机制
1.2.1 化学转向酵母途径
化学转向酵母途径曾经一次大战中德国用于工业化生产 1000t/ 月丙三醇。其生产机理是在基本培养基下用酿酒酵母对蔗糖和葡萄糖等己糖进行厌氧酵解，通常其主要酵解产物为酒精， 如（1）、（2）式， 当把EMP途径中乙醛作为氢的受体， 用 Na2SO3固定或通过Cannizzaro 反应由碱使乙醛形成乙酸和乙醇， 于是EMP 途径中由己糖产生的其他丙糖就作为主要的氢受体还原为丙三醇， 化学计量反应式如下：
C6H12O6+Na2SO3+H2O——NaHCO3+CH3CHO·NaHSO3+C3H8O3 （1）
2C6H12O6+H2O+碱——2CO2+CH3COOH+C2H5OH+2C3H8O3（2）
在工业化得制作过程中对硫氧粉运用量是有约束的，如果使用太多的硫氧粉会使酵母变得有毒，所以丙三醇使用糖的转化率是百分之二十到百分之二十五，客观上来讲是百分之五十一。糖度达到百分之二十的时候添入碳酸钠，差不多百分之二十五的丙三醇能够转化。运用糖蜜当做底料时，使用蒸馏水、溶剂等以往的方式提炼丙三醇就不是很经济划算的，所以这种商品回收率以及转化率和产率太低是工业上放弃使用这种方式的根本原因。
1.2.2 耐渗透压环境的丙三醇合成
在高渗透压环境下丙三醇是丝状真菌、藻类、昆虫、甲壳动物、脊椎动物中主要的渗透压调节剂，这是生物体细胞内积累低相对分子质量溶质以适应高渗透压环境， 调节细胞内外渗透压平衡维持生命的自然选择结果。在渗透压允许的条件下丙三醇可以对细胞中的酶和生物大分子的结构进行较大程度的保护，而且丙三醇的溶解性和粘度几乎不随其浓度的增加而受影响。基于这种生物适应环境的生理机制， 筛选高产丙三醇的耐渗透压酵母和藻类可以进行丙三醇的生产。
1.3 微生物丙三醇的提取
在发酵液里面提取丙三醇包含：①分开发酵液里面的细胞；②分开得到的清液使用酸碱调节为中性，过滤掉不能够稀释的固体物质，处置完毕使用多功能的蒸发设施进行浓缩，同时能够消灭乙醛以及乙醇这类发挥物体，最终在真空蒸馏中提取压缩的丙三醇，使用活性炭去除里面的颜色，获得工业中使用的丙三醇。使用亚硫酸盐方式发酵制作丙三醇的过程中，先使用蒸馏压缩的丙三醇发酵液，并且消灭其中的乙醛以及乙醇等物质，在对压缩液体进行纯化，在提取丙三醇的过程中大约会损耗掉百分之五到百分之十，因此使用溶剂提炼丙三醇花费较多。使用耐渗透压方式提取丙三醇回收方式和亚硫酸盐的做法差不多，这里使用方慧英策划的介质蒸馏措施解决了丙三醇真空蒸馏时速度慢、杂质多的难题，蒸馏率能达到百分之九十五以上，这确保了制造工业使用丙三醇的供应。
2 结束语
在我国因洗涤剂的普遍使用油脂的皂化和水解生产丙三醇产量有限，10年前从国外引进的化学合成装置因生产成本过高而无法生产， 因此我国丙三醇缺额将长期存在， 发展微生物丙三醇生产途径已无可取代。随着耐渗酵母途径的出现转向剂酵母途径逐渐淘汰，耐渗酵母途径可得到高产率的丙三醇， 可在采用自动控制设备， 降低劳动强度； 高密度细胞发酵， 提高生产强度上提高经济效益。细菌途径生产丙三醇还值得大量的研究。Dunaliell. sp 藻类培养生产丙三醇如收获藻体的方法得到改进则潜力较大，C.sp 则可以进行连续生产丙三醇， 也是一个产业化潜力较大的新领域。目前面临的主要困难是下游技术。传统的分离方法如离心、蒸发、蒸馏、液液萃取能量消耗及成本较大。耐渗透压酵母丙三醇的工业生产中虽然杂质成分与皂化和合成的丙三醇不同， 产品含有少量酸性物质， 但经过本单位近来的研究攻关产品质量已达医药级标准。时代在前进， 技术在不断进步。微生物丙三醇的生产工业正在起步， 相信利用基因工程手段筛选出更优良的工业生产菌株， 发展新的方法如超滤、反渗透、离子交换技术等提取手段， 采用先进的发酵技术和生产控制设备将使微生物丙三醇的生产水平迈入一个新的时代。
论文关键词：微生物作用 地球化学 水力性质 生物修复
论文摘要：综述了地下含水层系统中微生物作用。引用研究实例论述了微生物作用不但可以改变地下水化学组分，而且还可以改变含水层的水力性质。微生物作用对地下水系统的影响程度主要受微生物代谢速度､水文地质条件､含水层岩性等多种因素控制。地下水系统中电子供体与电子受体间的丰度关系是影响微生物代谢速度的主要因素。在未污染的含水层中，电子供体的可用性限制了微生物的新陈代谢，而在人类活动污染的含水层中，微生物的新陈代谢受电子受体的可用性的限制。利用微生物作用可以降解地下水系统中氯代化溶剂､烃类､硝酸盐､有毒金属等多种化学污染物。并对今后的发展方向进行了探讨。
1 引 言
地下水系统具备了微生物生长发育所需的营养､水分､酸碱度､渗透压和温度等条件，为微生物提供了良好的生存场所。微生物(主要指各种细菌菌群，如异养菌､自养菌､好氧菌､厌氧菌等)成为地下水生态系统中主要生命组分，是地下水演化过程的重要影响因子，在地下水系统的能量转换､物质循环､营养输送､信息贮存以及元素形态的转化､聚集和迁移中微生物都起着极其重要的媒介作用。地下水化学性质的演变中微生物的控制和改造是其主要因素之一。
地下水系统是一个复杂综合体，包括了地下水流经的介质，地下水中各种物理化学成分和地表的天然通道等。加之人类对地下水的开发利用活动已经并将继续改变地下水环境，如地下水的污染､过量的开采以及其它流体矿产的开发等都对地下水系统的天然环境产生影响。环境因素的变化相应地也影响了地下水中生物的生存条件，导致微生物的形态､生理､遗传特性的改变，促使各类微生物不断演替。地下水系统中各种环境因素又是制约微生物生长､繁殖的重要因素。
地下水微生物学是地下水科学与微生物学紧密结合而形成的一门新兴学科，它将地下水视为一个有生命的系统加以研究，主要研究与认知微生物生命过程与地下水化学密切相关的科学问题，是研究微生物活动与地下水环境相互关系的科学，也就是探索微生物直接参与地下水化学形成演化过程的微生物地球化学作用，是地下水科学研究的前沿领域。
2 微生物作用改变地下水化学组成
早在1900年人们就发现未受污染时含有高浓度硫酸盐的地下水，受石油污染后却常常缺少溶解性硫酸盐。1917年Rogers首次提出这是硫酸盐还原菌新陈代谢的作用所致。这个假设在从受石油污染的水中分离出硫酸盐还原菌时得到证实。在以后的几十年里，很多学者对地下水化学组成的微生物影响作用进行研究后认为，微生物对地下水化学组成具有重要影响作用(Chapelle 2000)。如，钟佐燊(2001)研究认为，在石油烃污染的地下含水层中，如果发生了生物降解反应，则其水文地球化学标志是：水中溶解氧很微，NO-3和SO2- 4明显降低，Fe2+ 和HCO-3升高，出现HS-或H2S 和CH4。
地下水系统中电子供体与电子受体间的丰度关系是影响微生物代谢速度的主要因素。在未污染的含水层中，电子供体的可用性限制了微生物的新陈代谢，溶解性无机碳沿着含水层流动路径慢慢聚积，可用的电子受体依照溶解氧>硝酸盐>三价铁>硫酸盐>二氧化碳(甲烷生成)的次序不断被消耗。在人类活动污染的含水层中，常存在过剩的可用有机碳，电子受体的可用性限制微生物的新陈代谢。
美国南卡罗莱纳州Black Creek含水层是区域地下水化学类型变化受电子供体限制的很好例子。McMahon等(McMahon 1991a1991b，Chapelle 1990)对该系统进行详细研究后，描述了微生物作用对含水层地下水化学组成的影响。该水文地质单元，水流从补给区向下游150 km到排泄区，溶解性无机碳浓度从不到1 mM/L 增加到超过12 mM/L。由微生物代谢作用产生的溶解性无机碳促进了含水层中碳酸盐的溶解，根据公式：CaCO3 (碳酸盐)+CO2 (微生物)Ca2+ +2HCO-3计算得出，大约一半的溶解性无机碳来自微生物代谢作用(约6 mM)，有研究表明该地区地下水补给大约需要用15万a，由此推出，微生物代谢作用产生溶解性无机碳的速率约为10-4 mM/La。因此，尽管沿地下水流溶解性无机碳浓度增加很大，但微生物代谢速度很低(Chapelle 1990)。其主要原因是，含水层中可代谢的有机碳含量低。McMahon(1992)研究认为，Black Creek含水层中有机碳含量只占沉积物干重的0.1±1.0%。由于低速率的微生物代谢作用，系统中可用电子受体的量(O2､Fe3+､硫酸盐和CO2)相对有机碳来说是丰富的。
当地下水系统中可用有机碳的含量很高时，可用电子受体缺乏会限制微生物代谢作用。电子受体受限的含水层包括泥炭含水层(普遍在北半球)，石油储存地，和由人类活动引起化学污染的含水层。1979年美国明尼苏达州管道爆裂泄漏大约10万加仑的原油到一个冰水沉积含水层。泄漏时，由于与大气快速交换，以及含水层天然有机碳含量低，地下水呈饱和溶解氧状态(约10 mg/L)。随着可代谢碳的突然流入，油积聚在水面，氧被迅速消耗，并形成三价铁还原条件。泄漏后5年，在油透镜体附近含水层中氢氧化铁被耗尽，甲烷生成成为一个重要作用。这个受原油泄漏污染的浅层含水层是电子受体受限含水层最好例证之一(Baedecker 1993)。
由于原油泄漏电子供体过剩，在最接近污染源的Bemidji含水层，其水化学特征主要为甲烷生成环境，其次为硫酸盐还原，铁还原，和低溶解氧环境。该含水层与Black Creek 含水层的情况完全相反，Black Creek 含水层甲烷生成的地方远离补给区。而Bemidji含水层的硫酸盐相对较少，硫酸盐还原不是主要的作用。这种氧化还原作用的次序是电子受体受限的地下水系统的特征，常见于受石油烃污染的地下水系统。
3 微生物作用改变含水层水力性质
微生物作用除影响地下水化学组分以外，也影响地下水系统的物理性质。地质学家很早就知道在非孔隙岩中，次生孔隙能提高含水层的水力性质 ，还可以积聚石油。人们通过大量的同位素和质量平衡研究得出，有机物的去碳酸基和其它无机作用不能解释许多系统中的次生孔隙现象(Lundergard 1986)。由于大多数含水层系统中存在大量具有活性的不同微生物种群，微生物代谢作用引起人们的关注，大量研究表明微生物作用能引起硅酸盐和碳酸盐岩中次生孔隙产生(Bennett 1987，Chapelle 1988)。地下水中硫酸盐在有脱硫细菌参与和有机质存在的条件下发生还原反应而产生H2S(Na2SO4+2H2O+2C2NaHCO3+H2S)，这个反应有溶解硫酸盐的作用，反应产生的H2S 溶于水中也具有溶解碳酸盐等矿物的能力(李义军 2002)。
微生物作用除显著改变了Black Creek 含水层水化学组分外，也改变了这个含水层的水力性质。沿水流路径的岩心资料显示了一个显著的岩性变化。在补给区，不存在次生晶粒间的方解石胶结物。在补给区和排泄区的中间区域，南卡罗莱纳州莱克市常见方解石胶结物。在排泄区附近，南卡罗莱纳州莱克市Myrtle 海滩，50%的厚层含水层被晶粒间的方解石胶结。McMahon等研究了微生物作用引起Black Creek含水层孔隙的填充现象。该研究表明，Black Creek含水层的砂中含有机碳少，而相邻的狭窄的层中含有丰富的有机碳。隔水层有机碳的发酵使有机酸在隔水层孔隙水中积聚。有机酸扩散到Black Creek含水层，进而氧化为二氧化碳，引起大量的碳从隔水层迁移到含水层。二氧化碳同含水层物质反应产生碳酸盐和重碳酸盐。这个作用导致部分含水层次生孔隙产生。然而，当碳酸盐和重碳酸盐在溶液中积聚､运移，地下水的方解石变得过饱和时，就会在含水层的其它部位沉淀下来。由于丰富的晶粒间的方解石胶结物填充了含水层系统的主要孔隙，Black Creek含水层孔隙性减少，透水性降低，以至不能满足当地用水需求。
有实验表明，二氧化碳和有机酸的产物能增加矿物的溶解，引起次生孔隙性和渗透性的发展。而碳酸盐､铁和硫酸盐微生物产物能引起方解石或黄铁矿的沉淀，降低地下水系统的原生孔隙性和渗透性。也就是说，微生物既能破坏(Lundergard 1986)也能提高(Hiebert 199 McMahon 1995)含水层沉积物孔隙性。
4 污染修复中的微生物作用
现代社会产生了大量的化学产品，许多有毒有害的物质被人类有意或无意地投放到地下水系统中，地下水受到严重污染，地下水质量日益恶化。近年来，生物降解技术以其可在污染现场进行修复､可在难以处理的地方进行修复､在生物修复时不影响场地内正常生产､对污染地的干扰或破坏小､处理后的产物无二次污染､降解过程快､费用低等诸多优点受到世界各国环境科学界的广泛关注，激发了人们对污染修复中微生物作用的研究兴趣。
对污染地下水进行原位生物修复时，好氧微生物通过将有机化合物氧化成二氧化碳而获取能量，其中氧为电子受体，当地下存在氧时，好氧微生物可将有机污染物氧化成二氧化碳，从而使污染地下水净化。厌氧微生物也能将有机化合物氧化成二氧化碳，但其作用过程中的电子受体不是氧，而是以硝酸盐､硫酸盐或Fe3+等氧化物作为电子受体。由于许多受污染的地下水环境中缺乏氧，好氧微生物在代谢过程中很快将氧耗尽，此时，好氧微生物将无法对污染物进一步降解。厌氧微生物不同的代谢能力，在污染地下水修复方面显示了巨大的潜力。最新研究表明，厌氧微生物可有效降解地下水中烃类､氯化溶剂､硝酸盐以及铀､铬､锝､钴､硒有毒金属和准金属等污染物。
在1973年，人们首次发现了浅层地下水中的土著微生物对石油的降解能力，不久，生物降解被用于提高汽油污染的含水层的净化。自那以后，人们开始使用生物降解地下水系统中各种常见化学污染物，包括氯代化溶剂。
地下水中石油烃的污染主要来自汽油及其它石油产品的地下储罐的渗漏。其主要污染组分为苯､甲苯､乙苯和二甲苯。生物降解石油烃的实质是在微生物参于下的氧化还原反应。该反应中电子供体烃给出电子，好氧菌仅利用氧作为电子受体，而厌氧菌则可利用NO-3､Fe3+､SO2-4和CO2 作为电子受体。美国密执按州使用原位生物修复技术，成功修复了由于地下储油罐漏油受到严重污染的包气带及含水层。其方法是：在污染区，首先注入未污染地下水42 d，第43 d开始注入含NO-3的地下水，到第112 d基本清除了污染物。结果表明： 地下水中，苯从0.76 mg/L降至小于0.001 mg/L ，甲苯从4.5 mg/L 降至小于0.001 mg/L；包气带土壤中，苯从0.84 mg/kg降至0.017 mg/kg ，甲苯从33 mg/kg 降至0.103 6 mg/kg(钟佐燊 2001)。
多环芳烃具有毒性，对人类健康造成的危害大，尤其是高分子多环芳烃的致突变与致癌特性。多环芳烃生物降解研究日益受到了人们的重视。近年来人们对微生物降解多环芳烃的作用､机理进行了广泛的研究，研究结果表明，对可降解多环芳烃的微生物有红球菌属( Rhodococ2cus) ､假单胞菌属( Pseudomonas ) ､分枝杆菌( My2cobacterium) ､芽孢杆菌属( Bacill us ) ､黄杆菌属( Flavobacterium) ､气单胞菌属( Aeromonas ) ､拜叶林克氏菌属( Beijernckia ) ､棒状杆菌属( Corynebacterium) ､蓝细菌( Cyanobacteria) ､微球菌属( Micrococcus ) ､诺卡氏菌属( Nocardia) 和弧菌属( V Ibrio)等(温洪宇 2005)。利用微生物去除地下水中的多环芳烃不会造成二次污染，费用低，易操作，是去除多环芳烃的最佳方法。
饮用水中过量的硝酸盐能够引起婴幼狼高铁血红蛋白血症，我国许多地区浅层地下水已普遍受到硝酸盐不同程度的污染。张胜(2005)对地下水硝酸盐污染的微生物修复技术进行了研究。通过两年多的室内和野外原位的大量试验研究，优选出反硝化菌液和增强地下水中微生物反硝化作用的营养碳源乙醇､乙酸钠，利用乙酸钠作为营养碳源在野外试验井进行原位微生物脱氮试验，对地下水中NO-3的去除率可达98%。研究结果得出，利用优选反硝化菌液和乙酸钠营养碳源对地下水硝酸盐污染修复效果好，在大面积土体和地下水污染原位修复技术实施是可行的､有效的，它不仅可以在原位有效地修复土壤､包气带的硝态氮污染，而且还可以增加土壤的肥力及氮肥的利用率，无负面作用，对修复污染､保护地下水资源和农作物增产都具有重要意义。
5 影响微生物作用的地下水环境因素
微生物作用对地下水系统的影响程度主要受微生物代谢速度，水文地质条件，含水层的岩性等多种因素的控制。
张宗祜，任福弘等(2006)为研究氮素的生物化学循环问题，通过对河北正定野外试验场贯穿包气带的18.5 m的钻孔剖面土样的水理性质､地球化学成分､有机质含量的测试和微生物的培养鉴定，发现包气带土体的各类细菌在整个包气带均有分布，但随着岩性､物理化学条件的变化，而显现出不同的细菌含量，特别是在几个层次上出现细菌含量高的活化层。它的出现充分说明了细菌在包气带中分布，不是受深度变化所控制，而是受其环境条件所制约，如含水量､营养元素､土体岩性等。这一研究成果为今后深入研究地下水系统中微生物的作用奠定了良好的基础。
McMahon(2001)研究了含水层和弱透水层交界面上的几个重要生物地球化学反应，包括氧还原､反硝化作用和Fe3+､SO 2-4和 CO2还原(甲烷生成)。研究表明，一些地方，生物地球化学反应发生在交界面的弱透水层面，电子受体从含水层运移到电子供体丰富的弱透水层里。另一些地方，生物地球化学反应发生在交界面的含水层一方，电子供体(有时是电子受体)从弱透水层运移到电子受体或微生物丰富的含水层里。影响含水层/弱透水交界面发生生物地球化学反应范围的因素有，交界面两边电子受体和电子供体的丰度和可溶性，电子受体和电子供体反应和越过界面的速度。
6 展 望
地下水沉积物无菌取样方法的发展完善和微生物综合评价方法的建立，使微生物代谢作用对地下水地球化学的影响被广泛认识。随着当今社会科学技术的不断进步，地下水微生物地球化学的研究技术也日益得到提高和改进。首先，人们可以利用电子显微镜､能普､电子探针､离子探针､质子探针来观察和分析细胞内部的结构､成分。第二，微生物生态学研究的新技术被用于地下水微生物研究中。如，人们在研究污染或未污染含水层生物群落组成研究中开始使用磷脂脂肪酸分析方法(PLFA)，该方法是基于生物化学手段的一种微生物生态学研究新技术，它具有对细胞生理活性没有特殊的要求，对样品保存时间要求不高､不需要进行微生物培养等优点。它能提供微生物群落生物量及其时､空变化､群落结构和功能等多种微生物信息，是一种快捷､可靠的分析方法。.再如，人们通过基因工程，在DNA的分子水平上动手术，使某种细胞结构的基因转到另一种细胞中去，而使之具有新的遗传性状。
随着我国环境科学界对地下水微生物作用研究的日益关注，我国地下水微生物地球化学､微生物工程学､微生物环境工程学将会作为重点发展学科被大力扶持，地下水微生物的基础研究应得到优先发展，尤其是在地下水环境中微生物的种类､形态､分布特征､营养和生长的一般规律，微生物的代谢､演替和调控，微生物的基因及其所携带的遗传信息表达等研究方面，从基础研究中寻找提高地质微生物地球化学作用的研究途径和方法。地下水微生物研究将进一步与地质学､微生物学､环境生态学､环境微生态学､环境地质学､水文地质学､生物化学等基础科学的研究交叉与合作，对基础科学的发展提供动力和应用的验证方法。
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【关键词】 水处理 微生物絮凝剂 絮凝机理 影响因素
为满足水质标准和环境排放要求，在给水和污、废水处理过程中，一般向水中先加入一定量的絮凝或助凝剂，改变胶体颗粒的表面特性、破坏其稳定性，使分散的胶体颗粒相互聚集进而形成较大的颗粒物，最终从水中沉淀或上浮，以实现固液分离，达到水质净化的目的。
作为第三代絮凝剂，微生物絮凝剂是一种利用生物技术，通过细菌、真菌等微生物经发酵、抽提、精制而成的物质，主要成分为多糖、多肽、蛋白质、脂类及其复合物。按其来源进行分类，微生物絮凝剂大致可分为：（1）直接利用为生物细胞的絮凝剂，如大量存在于土壤、活性污泥中的细菌、真菌及发酵菌等；（2）以细胞壁提取物（如细胞壁中的甘露聚糖及蛋白质等）为主要成分的絮凝剂；（3）以微生物代谢产物（包括胞外代谢产物及胞内代谢产物）为主要成分的絮凝剂；（4）利用克隆技术所获得的絮凝剂[1]。
1 絮凝机理
1.1 吸附架桥机理
尽管微生物絮凝剂的性质各不想同，但它们对液体中固体悬浮物颗粒的絮凝作用却有相似之处，它们可通过离子键、氢键等作用与固体悬浮物相结合。电镜显微镜下显示：聚合细菌之间是由细胞外聚合物搭桥相连的，也正是这些使得微生物细胞削弱了胶体的絮凝稳定性，进而较为紧密地聚合成絮凝体从液体中沉淀分离出来。微生物絮凝剂的架桥机理如图1所示。
在低浓度微生物絮凝剂环境中，呈链状结构的该类物质可同时附着在多个胶体微粒的表面，形成“胶粒-高分子物质-胶粒”的聚合物，在重力的作用下最终导致絮凝沉淀的出现。吸附架桥的必要条件是在胶体微粒表面存在空白空间。在通常情况下，微生物絮凝剂的絮凝效果随着该絮凝剂分子量的增加而加强，即分子量增加，絮凝效率亦随之提高；在架桥的过程中，倘若出现了微生物絮凝剂链段间的重叠，则亦会产生一定的排斥作用：在这种情况下，过高的絮凝剂分子量会削弱架桥作用，并最终降低絮凝剂的絮凝效果。相反，当用微生物絮凝剂处理相反电性的胶体颗粒时，则往往会加大微生物絮凝剂的解离程度，造成絮凝剂电荷密度的加大，有利于絮凝剂分子的扩展，进而促进了微生物絮凝剂的架桥作用。
1.2 电性中和机理
在使用微生物絮凝剂对水体进行处理的过程中，通过加入一定量的金属离子或对水体pH进行一定调节，可对该絮凝剂的处理效果产生一定的促进或抑制作用。实验研究[2]证明：该操作是通过改变胶体表面的带电性而起作用的。通常情况下，在水体中以絮凝稳定性存在的胶体粒子往往带有负电荷，当带有一定量正电荷的链状高分子微生物絮凝剂或其水解产物靠近这种胶体粒子时，在胶体表面上将会发生正负电荷的相互抵消，进而出现胶体脱稳的现象，使得胶粒之间、胶粒与絮凝剂之间的自由碰撞加剧，并在分子间的力作用下形成一个整体，最终依靠重力的作用从水中沉淀分离出来。
1.3 化学反应机理
絮凝效率与温度关系的研究实验[3]显示：在30℃条件下，微生物的絮凝效率可达到85.2%；相比之下，在15℃条件下，却只有42.1%的絮凝效果。实验研究表明：温度对微生物絮凝剂的作用主要是通过影响其活性基团，进而影响其化学反应，最终起到对微生物絮凝效果的促进或抑制作用。
高分子微生物絮凝剂中存在一定数量的活性基团，该基团在微生物絮凝过程中扮演着重要的角色。研究显示：微生物絮凝剂中的某些活性基团可与胶体表面上相应的基团产生化学反应，进而凝聚成体积较大的颗粒物质，最终从水体中沉淀分离出来。另有研究显示：通过对微生物絮凝剂进行一定的改性、处理，使其添加、减少或是改变某些活性基团，絮凝效果将会出现很大程度的变化。
2 絮凝效果影响因素
2.1 培养条件的影响
在营养充裕的培养基中，微生物絮凝剂的絮凝特性与培养时间及培养温度有关。实验结果[4]显示：微生物絮凝剂的絮凝活性随着培养时间的延长而有所提高，即在培养的初始阶段，微生物絮凝剂的絮凝活性随培养时间的延长而基本上呈线性增长的趋势，直到达到某一最佳培养时间后，微生物絮凝剂的絮凝活性增长速度开始减弱，最终趋近于某一极限值；此外，温度可影响蛋白质空间结构及化学特性，进而可促进或削弱以蛋白质为主体的微生物絮凝剂的絮凝特性，因而同一种微生物絮凝剂在不同的培养条件下，会产生不同的絮凝特性，但大部分微生物絮凝剂在30℃左右的温度条件下，往往会出现最佳的絮凝特性。
2.2 pH值的影响
pH值是影响微生物絮凝剂絮凝效果的重要因素。不同的pH不仅会影响到微生物絮凝剂的形态结构及电荷性质，而且对胶体颗粒表面物化性质也会产生中的影响。不同的微生物絮凝剂对pH值有不同的敏感程度。实验结果显示：酸性条件可降低、甚至消除微生物絮凝剂的絮凝特性；相比之下，在碱性条件下，不同微生物絮凝剂的絮凝活性却出现了不同程度的提高，例如在使用微生物絮凝剂MBF3-3处理石油化工废水的试验中，在pH>10的条件下微生物絮凝剂才会达到最佳的絮凝效果。
2.3 絮凝剂分子量及浓度的影响
絮凝剂分子量及浓度也会影响到微生物絮凝剂的絮凝特性。试验结果[8]显示：分子量越大，会使得絮凝剂中活性位点增多，进而微生物絮凝剂的处理效果；相反，分子量的减小会削弱微生物絮凝剂的絮凝特性。例如，微生物絮凝剂经蛋白酶或其他相关酶水解处理后，由于微生物絮凝剂分子量的减少，出现了絮凝活性的显著下降。
另外，与其他絮凝剂一样，微生物絮凝剂的处理效果受其浓度而影响，并存在微生物絮凝剂的最佳投加量：在低浓度条件下，微生物絮凝剂的絮凝特性随着絮凝剂投加量的增加而提高；当浓度达到一定程度后，再继续增加微生物絮凝剂，微生物的絮凝效果变化不大，甚至出现了絮凝效果降低的现象。实践证明：当投加量达到覆盖胶体颗粒1/2表面积时，微生物絮凝剂在胶体颗粒上架桥的机率最大，往往会出现最佳的处理效果。
2.4 金属离子的影响
金属离子的种类和浓度对微生物絮凝剂的处理效果也会产生一定的影响。研究结果[5]显示：一定浓度的金属离子可以促使微生物絮凝剂与胶体颗粒以离子键的形式结合，进而提高其絮凝特性。
另外，不同价位的金属离子对微生物絮凝剂的絮凝特性有不同程度的影响：以Na+、K+为代表的一价金属阳离子，对微生物絮凝剂几乎没有促进作用；而以Ca2+、Fe3+等为代表的高价金属离子对微生物絮凝剂均有明显的促进或抑制作用。
为充分发挥微生物絮凝剂的絮凝特性，在实际应用中，通常将微生物絮凝剂伴随一定量的CaCl2，或是将微生物絮凝剂与Al2（SO4）2按一定的比例混合加入，这样可在提高微生物絮凝剂絮凝效果的同时，减少微生物絮凝剂的用量。
3 微生物絮凝剂在实际水处理当中的应用
微生物絮凝剂主要成分是微生物菌体或其次级代谢产物，具有适用范围广、絮凝活性高、安全无害且易生物降解的特性，因此可广泛应用于给水及污、废水的处理。
3.1 在给水及饮用水方面的应用
由于人为或天然方面的原因，给水及饮用水中不可避免的会包含一定量的颗粒甚至是有毒有机物及病原菌。微生物絮凝剂在饮用水除浊及灭菌方面，要比传统的无机盐絮凝剂及有机高分子絮凝剂拥有更高的处理效果，且具有絮凝剂用量少、适用范围广、沉淀物过滤性能好及可生物降解，对人体不会产生毒害作用的特性。
3.2 在富营养化水体处理方面的应用
水体富营养化多年来一直是一个困扰水处理工作者的难题，目前对于该水体污染尚无一个行之有效的办法。然而，有研究显示：微生物絮凝剂对富营养化水体有一定的处理效果。
为了探究微生物絮凝剂对于水体浊度的去除效果，黄玉柳等[6]从食用菌废弃物土壤中分离并筛选出了一株絮凝剂高产菌，并将其应用到富营养化水体的絮凝沉淀试验中，结果显示：在最佳的絮凝条件下，微生物絮凝剂对于富营养化水体光密度OD653的去除率可达到70%，即相当于使水体的澄清度提高了70%；同时，微生物絮凝剂对固体悬浮物可达到的62%的去除效果。
3.3 在印染废水脱色方面的应用
COD浓度高、可生化性差、成分复杂且对环境危害严重，使得应用常规的废水处理技术不能对印染废水产生较为理想的处理效果。实验证明：微生物絮凝剂在印染废水脱色及COD去除方面都具有较好地处理效果。为了检验微生物絮凝剂在处理印染废水脱色方面的可行性，李风琴等[7]利用制的微生物絮凝剂MHXGS2对靛蓝印染废水进行了处理，结果显示：在最佳絮凝条件下，MHXGS2对废水色度的去除率可达到96.5%。
3.4 在消除污泥膨胀方面的应用
利用活性污泥法对工业废水进行处理的过程中，往往会出现污泥膨胀，进而降低废水的净化效果。有研究表明：如果在废水的处理过程中，加入一定量的微生物絮凝剂，就可消除污泥膨胀，最终取得较好地处理效果。如在甘草制药废水的生化处理过程[12]中，就会往往出现污泥膨胀，通过加入一定量的微生物絮凝剂NOC-1，就可使得污泥容积指数SVI很快地由290降到50，即可消除污泥膨胀，最终恢复污泥活性。
4 结语
尽管目前对于微生物絮凝剂的研究，大部分还处于试验阶段，但自然界中天然存在着多种絮凝微生物，且该类微生物具有生长繁殖迅速、易于实现产业化的特点，因而对于微生物絮凝剂的研究正日益引起人们的重视。
目前我国对于微生物絮凝剂的研究尚处于初级阶段，为实现微生物絮凝剂在我国的快速工业化，可着重对以下方面进行研究。
（1）深入对微生物絮凝剂的结构、絮凝机理及影响因素的研究。只有对这些因素的深入研究，才能更好地开发和生产出高效的微生物絮凝剂。（2）着重对各微生物菌种生态位的研究。微生物生态为理论指出：不同微生物菌株共存时，微生物的絮凝特性将会有所提高，并对水质有很好的处理效果；但是并不是任何菌种的混合培养即可提高微生物的絮凝特性，当两菌株之间的生态位出现重叠时，将会导致絮凝活性的显著降低。（3）注重复合型微生物絮凝剂的开发。在废水的净化处理中，依靠单一的絮凝剂很难取得较为理想的处理效果，而通过对各种絮凝剂按一定比例的复配使用，不仅可以提高絮凝效果，而且对可以在一定程度上减少絮凝剂的用量。（4）加强对絮凝剂产生菌在基因控制上的研究。通过应用菌株诱变或现代分子生物学技术对微生物絮凝剂的遗传基因进行改造，构建新的微生物絮凝剂产生菌，以期获得同时具有较高生物活性及絮凝能力的超级工程菌。
随着对微生物絮凝剂研究的逐步深入，相信在不远的将来，将会在给水及工业污、废水处理中得到更为广泛的应用，并最终取代或部分的取代传统的无机盐及有机高分子絮凝剂。
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关键词:微生物学;创新;教学改革;考核
微生物学是一门实践学科，其理论知识来源于实验，实验课是微生物学的重要组成部分。近年来，微生物学发展突飞猛进，新技术、新成果不断出现，传统教育模式也面临挑战［1，2］。很多农业院校实验教学工作者逐渐意识到传统实验教学存在实验内容陈旧、限制学生视野、创新能力不足等问题，达不到重实践和提高学生素质教育的目标，实验课程的教学改革已成为高等教育和本科教学评估中遇到的突出问题［3］，实验教学工作者开始思考如何更好开展微生物学实验课程教学，精心设计课程体系，以满足新时代社会发展对人才培养的需求［4～6］。上海交通大学作为一所综合性高校，其下设农业与生物学院拥有理学、农学、工学等多学科专业，针对全院不同的学科专业，微生物学实验的培养计划既要紧跟农业科技的发展调整实验内容，又要从各个专业视角增加学生知识面，使学生了解各自专业与微生物学的相关性，丰富知识领域视野，培养学生创新能力。农业与生物学院微生物学教学团队针对以往教学中存在的问题，在基本不改变实验课时的条件下，对实验教学体系进行重构，对部分内容和形式进行大胆改革尝试，把培养学生创新意识和能力放在首位，调整实验内容，改进教学方法，从实验内容、方法和考核方式等方面加强实验实践环节，促进观念、模式、内容和方法的全面改革，促进教学质量的提高，实现重知识传授到重创新思维能力培养的转变。
1微生物学实验课程教学体系的重构
1．1微生物实验课程内容的重新编排
验证性实验是通过验证某种认识或假说，使学生获得特定操作技能，在不断完善认知结构的基础上，促进学生验证和进一步理解所学理论，培养学生的实验基础能力［7］，然而教育的真正目的在于使学习者成为知识结构的设计者，使学习者善于学习，培养其创新能力［8］。单纯的验证性实验教学已不能满足高等教育的育人要求，而高校学生对验证性实验的学习也兴趣寡然、缺乏思考和主动性［9］。开设设计性实验，鼓励学生构思实验方案并付诸实施，对培养学生创新思维具有重要意义，设计过程是学生不断发现、解决问题的过程。减少验证性实验，增加综合性和设计性实验比重的观点已形成共识［10～12］。根据学院5个专业学生的培养计划和专业特点，我们对微生物实验课程内容进行重新布局(表1)。由表1可以看出，在学生掌握一定实验内容和操作技能的基础上，对实验内容进行整合，增加综合性实验项目。例如，在学生掌握显微镜使用及原核生物染色观察的技能基础上，将真核微生物的形态观察实验与微生物测量大小及计数实验串联合并成一个综合大实验项，使学生在一堂课中对微生物形态有系统的认知;增加“细菌总数与大肠菌群的测定”实验内容，并与“细菌快速生化鉴定”实验综合进行教学，使学生对样本中细菌与大肠菌群数定性和定量测定方法进行比较学习。综合实验项目不仅注重了实验内容之间的逻辑联系，同时增强了实验项之间的次序性和连贯性。实验教学内容变化的另一个特点是增加了设计性实验。例如将“环境因素对微生物生长的影响”作为开放性设计实验，学生根据已有知识并结合查阅文献等手段进行初步调研、选择适合自己或感兴趣的研究范围，确定具体的研究题目，设计实施方案。教师对学生方案的合理性、可行性和创新性进行评估并提供技术指导。开放性实验安排在实验课程后期，此时学生已掌握课程大部分基础知识，初步具备独立设计实验的能力，对其综合运用所学知识和自主学习是一种训练，同时又锻炼其创新设计的能力。由于方案思路、具体操作步骤、仪器用具等都是未知数，因而设计性实验的开展更具独立性和创新性，对学生更富有挑战性，能够激发学生完全投入到自己的实验研究中。
1．2将科学前沿和生活案例融入教学内容
生物技术飞速发展，新的实验技术方法层出不穷，作为综合性大学，将科研成果或技术路线转化成可供学生学习的教学项目，精心设计教学内容，融合本学科领域最前沿技术，增加学生新视野，提供学生熟悉和掌握先进科学技术的实践机会。例如由科研课题转化而来的实验项目—“单增李斯特菌感染对小鼠外周血ANAE+淋巴细胞的影响”(见表1)是依托于教学团队在研的国家自然基金项目，涉及李斯特菌感染和淋巴细胞的免疫效应的等研究热点，通过实验的讲解和学习使学生了解到李斯特菌对人类的危害和致病机理，将学术研究成果渗透到课堂，逐步实现由学习基础知识到科研接触的转化。微生物与生活息息相关，结合生活案例开展实验教学更容易引起学生的兴趣。在设计实验教学内容时，有意识的融入生活中与微生物学相关的实时案例，引入当前热点或有趣的话题作为教学切入点，将抽象知识化为具体有案例的实验教学。“动物病毒的接种与培养”和“尿素液收集与血凝和血凝抑制”实验时，结合当前社会热点“H7N9禽流感病毒”的案例阐述病毒抗原与阳性血清反应的原理及微生物学在生活和科研中的价值意义，同时引入病毒性质、疫苗研制过程等知识，极大增加了学生的学习兴趣;在“水中细菌总数与大肠菌群的测定”实验中，让学生到公园或餐饮场所采集检测水样，亲自动手检验生活周围的水环境。将生活案例融入实验教学是理论联系实践的有力证明，学生在实践过程中培养积极的学习体验兴趣和态度，在很大程度上促进学生的学习主动性和创造性的发挥，有利于发展学生的个性化［13，14］。
2教学方法的改革
2．1利用多媒体资源辅助教学
在形态观察实验中，通过显微镜观察的视野与教材图片有一定差异，对于初学者辨识有一定难度，学生学习效率低而且学习效果也不理想［15］。针对这一现象，我院引进MOTIC数码显微系统辅助教学，实现了有针对性的“一对一”辅导学生，而且实现了教师讲解和学生显微镜操作观察同时进行，学习更直观生动。借由数码互动系统拍照软件，将学生实验效果较好的视野进行拍片保存，按照原核生物与真核生物的不同属性分类建库，积累不同题材的微生物形态图片，供学生观赏学习，增加辨识度。同时，针对以往学生实验操作不规范等现象，对微生物学的基础实验操作技术和容易存在误区的操作方法进行拍摄录制成5～10min的视频，如划线分离、涂布平板、无菌接种等实验操作技术，在相应的教学内容中结合这些视频演示，增强示范性。学生观看学习演示视频后独立操作练习，老师进行总结分析，学生针对存在问题再次练习、强化训练，形成“观摩”—“练习”—“点评”—“复练习”的实践模式。将现代化的多媒体教学手段与常规教学手段结合，观摩学习、重点难点指导和反复训练的过程，加深学生印象，其操作更趋规范性，学习效率和效果也得到极大提高。
2．2鼓励学生自主教学
培养创新型人才，要培养学生自主学习、独立思考的能力。在真核微生物的染色与观察”实验中，分别请不同的同学在其各自的显微数码互动系统的终端显微镜下，现场完成对青霉菌、根霉菌、酵母菌等真核生物视野的寻找，指认各不同真菌的孢子形态、梗、根等结构指认，并对其繁殖方式进行简要叙述。学生讲解的视野同步展示在教师和其他同学的系统终端电脑界面，老师对其讲解进行点评，这一过程实现了教师和学生的角色互换，促使学生积极“备课”，主动学习，课堂气氛更加活跃。在学生自主设计实验研究期间，实验教学中心实行“三开放”，即实验项目、实验时间和实验室仪器材料的开放。具体操作为，老师提供开放的实验项目，学生根据兴趣自由选择题目;选定题目后，给予学生一定的时间查阅文献制定方案，学生可以机动灵活的自主安排实验时间而非局限于课堂有限的学时;在实验研究期间，实验室及仪器设备向学生开放，全力支持学生开展研究，破除了传统实验教学“固定”场所、“限制”时间和“统一”实验过程的固定架构，实现了以学生为中心自由发挥创造的目标。学生对于自己的实验处于主导地位，从设计到材料准备，从操作实施到结果分析，都亲自动手完成。整个过程有许多书本中无法学到的东西，让学生学会思考每一步操作的意义，对锻炼其逻辑思维及动手能力很有益处。实验结束时要求提交设计性实验的研究报告，包括实验目标方案、结果分析、创新点、对预期目标的完成情况等内容，并以PPT答辩的形式进行汇报，最后由教师对学生报告进行点评。自主式教学的过程鼓励了学生完成对自主学习到知识输出的过程，加深了对知识的理解，也是对其学习能力的培养。
3考核体系的重新构建
建立以能力考察为中心的实验课程多元化考核新模式，重视对学生实验过程的评价。以往的微生物学实验考核成绩方式为:实验报告占30%，实验理论考试占70%。这种考核方式容易造成学生不积极参与实验、抄袭报告的现象，而实验报告并不能真实反映学生的学习情况。多元化的考核体系，既保留了实验报告对本次实验的总结和期末考试知识水平的考察，又增加了对实践动手能力、综合素质能力和创新性思维的多方面考察。实验报告注重对实验结果分析和对实验成败的总结，培养学生科学素养和逻辑分析能力;期末考试涵盖课程实验项目的多数知识点，知识面考察较为综合;对平时实验的考核注重考察学生的实验操作技能和操作规范性，使学生更加认真对待实验课程的学习过程，而改变以往只注重实验报告的敷衍态度，这对于提升学生的实验素养和严谨的科学态度有较大促进作用，另一方面，对平时实验操作的考察也是对学生认真参与和完成实验的督促，也有助于教师得到学生真实学习效果的及时反馈;设计性实验鼓励学生课外拓展知识和查阅文献，在课堂上与老师交流发言，鼓励学生自主学习，对方案设计、报告总结和PPT汇报等综合考察，对于设计性实验出色完成者可提供加分项以示鼓励。
4教改成效
4．1实验操作规范性和学习积极性
提高由于考核方式增加了对平时实验操作和预习提问的考察，学生成绩不再仅依赖于实验报告和期末考试的形式，避免了学生敷衍了事的实验态度和和抄袭报告的顽疾，而且超过70%的学生在报告中主动分析实验结果，还有的同学引用参考文献对实验出现的问题进行深入分析，总结实验成败的因素。学生在操作显微镜时更加规范化，自觉擦拭油镜镜头、复位机械系统、整理实验用具等，这对于培养学生爱护贵重仪器、认真负责的科研态度有很好的促进作用。通过利用多媒体进行实验技术“观摩”—“练习”—“点评”—“复练习”的实践训练，反响效果较好，学生普遍掌握了规范的无菌操作和微生物分离纯化技术，课程成绩落实到实验具体操作，引起了学生对实验过程的重视。同时，由于对相关联实验教学内容进行了合并和调节，学生从整体把握对微生物培养、观察及研究其生化特性的过程，与以往老师提问时学生表现出知识零散紊乱、不积极应答的局面明显不同，课堂回答问题气氛活跃，多数学生能够按照老师的问题思路延伸思考、积极回答问题，学习热情饱满。
4．2学生在微生物相关研究课题的参与度增加
微生物实验教学改革实践运行后，我们统计了在创新实践项目和毕业设计中参与微生物相关课题的学生比例，分别有32．7%和50%的学生参加了与微生物相关的上海交通大学PRP项目和大学生创新计划IPP项目，在毕业设计论文中，55．6%的学生选择了与微生物相关的论文研究(上一级为42．3%)，研究课题的学术水平相对较高，如“灰略红链霉菌胞外蛋白酶产酶条件优化及克隆表达”“萨佩罗病毒感染宿主细胞特异性受体的筛选”“噬菌体裂解酶的制备及活性测定”“高产厚垣孢子木霉菌株构建机器拮抗特性研究”等既体现了学科前沿技术，又与实际生产有较强相关性，实用性强，吸引学生兴趣。学生通过微生物实验课程培养的实践动手和自主学习创新能力获得了自豪感和满足感，他们有自信能在导师带领的团队大课题中承担部分研究内容，在实践过程中表现出的多视点多方法创造性的思维得到了导师的肯定，提升了学术水平和团队合作精神。
5结语
微生物实验教学重在培养学生实践能力和创新能力，通过对实验教学内容、教学方法和考核体系的改革，摸索出培养学生开放性思维和创新能力的实验教学“新”模式，以培养学生能力为核心，给予学生充分的发挥空间，调动积极性和挑战性，从而适应高校创新型人才的培养目标。
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关键词微生物;生物能源;研究现状;应用
中图分类号 Q939.9 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)11-0282-03
随着可再生能源的迅速发展,人们对能源微生物的重视程度日益增加[1]。能源微生物主要包括甲烷产生菌、乙醇产生菌、氢气产生菌、生物柴油产生菌和生物电池微生物5大类,这些微生物分别与沼气、生物乙醇、生物氢气、生物柴油和生物燃料电池等能源的转化有直接的关系[2-4]。能源微生物以农业、林业废弃物和城市垃圾为原料产生绿色、可再生能源,对社会和环境的和谐发展具有重要意义。进一步了解和应用能源微生物是绿色农业和生态环境可持续发展中的1个重要而深远的研究课题,有待于进一步的研究、开拓和探索。
1能源微生物种类及转化机理
根据安斯沃思(Ainsworth)的分类系统,伯杰(Bergey’s)细菌鉴定法和洛德(Lodder)酵母菌鉴定法,能源性微生物主要分为5大类[5-8]:
甲烷产生菌的主要种类有甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷八叠菌属(Methanosarcina)、甲烷球菌属(Methanoccus)等[5]。其作用是在生物质原料的厌氧发酵过程中,产生以甲烷为主的沼气[6]。
乙醇产生菌的主要种类有酵母菌属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、克鲁弗氏酵母属(Kluveromyces)、曲霉属(Aspengillus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、卵孢酵母属(Oosporium)等[7]。其作用是将复杂有机物酵解生成乙醇[8]。
氢气产生菌的主要种类有红螺菌属(Rhodospirillum)、荚硫菌属(Thiocapsa)、红微菌属(Rhodomicrobium)、外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、蓝细菌类硫螺菌属(Thiospirillum)、板硫菌属(Thiopedia)、梭杆菌属(Fusobacterium)、闪囊菌属(Lamprocystis)、网硫菌属(Thiodictyon)、埃希氏菌属(Escherichia)等[9]。生物制氢是利用产氢微生物的生理代谢过程发酵产生氢气[10]。
产油微生物包括酵母、霉菌、细菌和藻类,常见的有:浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、弯隐球酵母(Cryptococcus albidun)、茁芽丝孢酵母(Trichospiron pullulans)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces)、产油油脂酵母(Lipomy slipofer)、类酵母红冬孢(Rhodosporidium toru loides)、胶粘红酵母(Rhodotorula),土霉菌(Asoergullus terreus)、紫瘫麦角菌(Clavicepspurpurea)、高粱褶孢黑粉菌(Tolyposporium)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、卷枝毛霉(Mucor-circinelloides)、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)等霉菌,硅藻(diatom)和螺旋藻(Spirulina)等藻类[11]。微生物油脂是指某些微生物在一定条件下将碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂等碳源转化为菌体内大量储存的油脂[12,13]。
生物电池的微生物包括脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)、腐败希瓦菌(Shewanella purefaciens)[14]、大肠杆菌(Escherichiacoli)[15]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[16]、地杆菌(Geobacteraceae sulferreducens)[17]、丁酸梭菌(Clostridium byt-yricum)[18]、嗜甜微生物(Rhodoferax ferrireducens)[19]、粪产碱菌(Alcaligenesfaecallis)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinanm)等。它们在新能源开发[20]、微生物传感器[21]和水处理工艺[22]方面有良好的应用前景。
2能源微生物研究与应用概况
2.1甲烷产生菌
近20年来,我国科研工作者对厌氧消化处理中的产甲烷菌进行了非常深入的研究。1980年周孟津和杨秀山分离出巴氏八叠球菌;1983年钱泽澎分离出嗜树木甲烷短杆菌和甲酸甲烷杆菌[23];1984年赵一章等分离出马氏甲烷短杆菌菌株C-44[24]和菌株HX;1985年,张辉等分离出嗜热甲酸甲烷杆菌[25,26];1987年刘光烨等在酒窖窖泥中分离到布氏甲烷杆菌CS[27],钱泽澎等分离出亨氏甲烷螺菌[28],1988年陈美慈等分离出嗜热甲烷杆菌TH-6[29]。而在最近的十几年里,又陆续发现一些新的产甲烷菌种,2000年孙征发现的弯曲甲烷杆菌Px1[30],极大地促进了产甲烷菌的研究进程。我国现在采用人畜粪便、农副产品下脚料、酒糟废液和其他工业生产中的废液等生产甲烷,用于照明、燃烧等,其使用价值是相当可观的。例如日产酒糟500~600m3的酒厂,可日产含甲烷55%~65%的沼气9 000~11 000m3,相当于日发电量12 857~15 714KW,日产标准煤17.1~20.9t,可以代替橡胶生产中烘干用油的30%~40%。我国年产木材采伐废物1 000万吨,油茶壳75万吨,胶渣13万吨,纤维板生产废液350万吨和亚硫酸纸浆废液180万吨为原料,通过微生物作用可获得沼气1 780亿立方米。同时,使上述废液的净化率达30%~60%,并可获得单细胞蛋白饲料约9万吨(按1.7%得率计)[31]。
2.2乙醇产生菌
燃料乙醇具有燃烧完全、效率高、无污染等特点,用其稀释汽油所制成的“乙醇汽油”,功效可提高15%左右。制作乙醇的原料丰富,成本低廉。1988年,巴西就有88%的新轿车的发动机使用乙醇作燃料。美国计划2006~2012年间,燃料乙醇年用量从1 200万吨增加到2 300万吨。英国、德国、荷兰等农业资源丰富的国家,也在进行燃料酒精的生产[32]。我国纤维素资源充足,年产植物秸秆约6亿吨,如果其中的10%经微生物发酵转化,就可生产出乙醇燃料近800万吨,其残渣还可用作饲料和肥料,因此发展纤维素乙醇前景广阔[33]。1993年,Ho等[34]将木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因转入酿酒酵母,首次成功构建出利用葡萄糖和木糖生产乙醇的工程酵母。Sonderegger等[35]将多个异源基因导入代谢木糖的酵母工程菌,重组酵母不仅降低副产物木糖醇的量,所得乙醇产量比亲株提高25%。现有乙醇菌种大多耐受力差、副产物多、对发酵条件要求苛刻,今后研究应致力于筛选优良性状的菌株,或利用基因工程手段选育高产纤维素酶、木质素酶菌种以及能克服上述问题的菌种,对其酶学特性、功能基因进行研究,优化发酵条件,辅以工艺措施的改进,提高燃料乙醇生产效率并降低成本。
2.3氢气产生菌
微生物制氢是一项利用微生物代谢过程生产氢气的生物工程技术,所用原料有阳光、水,或是有机废水、秸秆等,能克服工业制氢能耗大、污染重等缺点;同时,由于氢气的可再生、零排放优点,是一种真正的清洁能源,受到世界各国的高度重视。杨素萍等[36]利用琼脂固定化Clostridium butyricum 菌株以糖蜜酒精废液为原料进行产氢。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和麦芽糖假丝酵母(Candida maltose)在36℃混合发酵废弃物48h,产氢速率可达15.42mL/h・L,明显高于单个菌种。此外,利用豆渣、堆肥、活性污泥产氢的报道相继问世。目前的研究应努力改进生产工艺,逐渐明确微生物产氢机理,保证其在产氢过程中的高效性、稳定性和对不同生态条件的适应性,相信不久的将来微生物制氢将成为世界能源的一个重要支柱[37]。
2.4产油微生物
目前,国内绕着如何提高油脂含量,在菌种和发酵工艺方面开展了大量的研究,成功研制国际水平的产脂微生物菌种与生产工艺[38]。使用生物柴油对人类健康和全球危害都相对较轻,排放物中多环芳香化合物和亚硝酸多环芳香化合物含量水平低,二氧化碳和一氧化碳排放量仅为石油的10%,具有较好的生物降解性能。开发微生物油脂生产生物柴油,在降低污染、增加产量方面较前二者有更大的优越性。开发微生物油脂,不仅微生物发酵周期短,受场地、季节、气候变化影响不大,还可以利用木质纤维素、工业废水、废气等资源丰富、价格低廉的原料进行生产,既能够解决人类资源短缺的问题,又可以保护环境,一举多得,具有巨大发展空间。美国国家可再生能源实验室(NREL)认为,微生物油脂发酵可能是生物柴油产业和生物经济的重要研究方向[11]。
2.5生物燃料电池微生物
生物燃料电池是一类特殊的电池,它以自然界的微生物或酶为催化剂,直接将燃料中的化学能转化为电能,不仅无污染、效率高、反应条件温和,而且燃料来源广泛,具有较大的发展空间。Hagerman[39]研究以含酸废水为原料的燃料电池,Kim等[40]利用微生物电池培养并富集了具有电化学活性的微生物,电池运行3年多,并从中分离出梭状芽孢杆菌。最近美国科学家找到一种嗜盐杆菌,其所含的一种紫色素可直接将太阳能转化为电能,电池里的单细胞藻类首先利用太阳能,将二氧化碳和水转化为糖,再让细菌自给自足地利用这些糖来发电。Pizzariello等[41]设计的两极室葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶酶燃料电池,在不断补充燃料的情况下可以连续工作30d以上,具有一定的实用价值。
3应用前景
微生物作为生物能的主要参与者,其最大特点就是清洁、高效、可再生,与石油、煤炭等传统能源相比,有利于环境保护,与太阳能、核能、风能、水能、海洋能等新能源相比,其来源广、成本低、受地理因素影响小。虽然目前存在一些技术问题,但开发潜力是巨大的,利用前景是广阔的。不仅如此,微生物在现有的非可再生能源利用上也功不可没,可提高石油开采率和褐煤利用率,降低二者的污染效应,当之无愧地成为实现能源可持续发展目标的关键因素。利用微生物生产能源和对其进行利用,不仅没有环境污染问题出现,而且还可使目前污染严重的环境状况得以缓解。更有发展前景的是,生产和使用微生物能源可以治理污染,变废为宝获得综合效益。
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