关键词：羊草；分子生物学；遗传多样性；组织培养；基因克隆
中图分类号：S543.901 文献标识码：A 文章编号：1007-7847(2007)04-0289-06
羊草(Leymus chinensis)是多年生禾本科赖草属草本植物，由于其环境适应性较强。具有耐寒、耐旱、耐盐碱等优点而成为松嫩平原的优势物种，同时羊草也是一种重要的牧草资源，蛋白质含量高，适口性好，耐践踏，在发展草原畜牧业方面具有重大的经济和社会效益，但羊草种子发芽率低、种子萌发最适pH值为8.0～8.5，加上过变放牧和草地盐碱化日益加重等原因，我国现存系统管理重点实验室项目(K09M6)羊草草地约有90％以上发生了不同程度的退化，因此，研究羊草的遗传分化、抗逆机理、栽培育种以及转基因等对于改善生态环境和草场建设具有重要意义，随着分子生物学对各个学科的交叉渗透，使羊草的研究从细胞水平进一步深入到分子水平，羊草属于异交植物，物种趋向于在种群中具有较高水平的变异性，仅在松嫩草原中西部靠近内蒙古高原东部草原上的羊草种群就数以千计，这为研究羊草种群的遗传多样性提供了对象，培养愈伤组织是进行羊草转基因研究的前期工作，但诱导率低的问题尚未得到解决，笔者结合自己的科研工作，对羊草分子生物学领域的研究成果加以综述，旨为羊草抗逆分子机理研究提供参考资料。
1 羊草遗传多样性研究
由于羊草生态适应性强、分布范围广、生境类型多样，在长期的适应和进化过程中，羊草种群之间在形态、生理、生态以及遗传特征方面均产生了趋异，RAPD(randomly amplified polymorphic DNA，随机扩增多态DNA)技术可以在对被检对象无任何分子生物学资料的情况下对其基因组进行分析，而且具有费用较低、方便易行、模板DNA用量少、不需要同位素，在安全性和实验操作上具有比AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增酶切片段多态性)、SSR(simple sequence rc-peat，微卫星重复序列)等分子标记更加简便易行等优点，从而使其成为目前研究羊草遗传多样性的最重要的手段之一，该技术主要是利用各种群羊草的总基因组DNA作为模版，筛选能够扩增出具有明显差异性条带的随机引物，以至少两次重复均出现的结果做0，1矩阵图，即有条带记为1，无条带记为0，计算总片段数及多态位点百分率、各种群间遗传相似系数和遗传距离，利用分析软件进行聚类分析从而得到其遗传结构树状图，
羊草RAPD分析可以用于研究羊草的种群关系以及遗传分化的影响因子，崔继哲等应用RAPD技术证明相似生境或同一地域的种群在一些位点上表现出相似或相同的变化，刘惠芬等运用RAPD技术对内蒙古典型草原不同生境8个羊草种群进行分析，聚类结果显示生境相似的种群能够聚在一起，而地理距离最近的种群不一定归为一类，说明小范围内羊草种群间的遗传分化与地理距离不存在相关性，而与其生境间的相似度相关，影响遗传相似性的不是单一因子而是各种因子的综合作用，较小地理范围内羊草种群间的遗传分化主要是由环境的异质性所引起的，笔者曾以采自中国大安碱地生态试验站(N45°36′，E123°53′)的羊草种子单株播种栽培，以每株羊草幼苗的地上部为材料进行RAPD分析，30个实验样品的平均遗传距离为0.1909，共可分为4个类群(待发表)，通过RAPD分析，还可以进一步将羊草遗传分化多样性的原因具体化，汪恩华等””利用分子标记与形态标记以21个有效随机引物中对9份羊草材料进行RAPD分析，对随机抽取的17份禾草种质进行了种质评估的比较研究，结果表明，羊草种质的小穗数、种子千粒重、叶色、有性繁殖量和结实率5个形态学指标与遗传多样性指标存在一定的相关性，应用RAPD技术对不同生境羊草在水分胁迫下游离脯氨酸含量的变化做聚类图比较分析，证实水分是影响羊草种群间遗传变异和生态型分化的一个最主要的因子，虽然水因子是影响羊草分化的一个主导因子，但是在实际研究工作中也认识到羊草变异和分化是多种生态因子综合起作用的结果(如温度、海拔、经纬度、土壤类型等)，而且各因子之间又是相互影响，在不同的生境中限制因子又是变换的，这就造成不同地理种群的羊草遗传分化过程的复杂性，由此可见，目前以羊草为实验材料的RAPD分析虽有许多报道。但是由于羊草本身具有较高的种群变异性。组成羊草群落的植物总计有357种，加之尚缺乏一种统一的标准分型方法，因此RAPD技术就成为研究羊草分类及来源的主要工具，在物种鉴定及遗传分化研究中发挥着重要作用。
除了RAPD技术以外，等位酶技术也可用于羊草遗传多样性分析，等位酶是指由一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不同，崔继哲等通过该技术，综合分析了松嫩平原11个羊草种群的遗传多样性及遗传分化指标，深入剖析了灰绿型和黄绿型两种叶色类型羊草种群之间的遗传差异，证明种群间的遗传距离与地理距离之间没有相关，崔继哲等还采用淀粉凝胶电泳技术，应用等位酶分析方法测定了松嫩平原南部微生境下羊草灰绿色和黄绿色两种生态型9个种群的遗传多样性和遗传分化程度，证明羊草种、种群和生态型水平都维持较高的遗传多样性，两种生态型之间有明显的遗传多样性差异及遗传分化，另外，对不同生境、不同分类种群的遗传结构分析发现羊草种群遗传变异度很高，但是无论如何归属，松嫩草原上的羊草种群遗传分化程度很低，推测可能与羊草为异花授粉、不同类型混生及种群间基因流强度大有关，刘杰等曾用SSR作为探针构建了羊草的遗传指纹图谱，为羊草种质资源评价、种间及种内亲源关系分析、生物多样性研究提供了有效手段，利用AFLP方法对我国不同地区分布的羊草材料进行的DNA多态性分析结果也表明了羊草基因组DNA具有比较丰富的多态性。
2 羊草愈伤组织培养及利用
植物组织细胞培养(plant tissue and cell cul-ture)是通过运用植物组织细胞培养技术实现植物育种获得新品种的一条快捷途径，既可以通过
花粉培养、未授粉子房以及胚株培养等诱导形成单倍体植物，也可以通过植物愈伤组织培养中普遍存在的染色体变异实现植物突变育种，另外，通过植物组织培养技术进行的植物细胞融合(尤其是原生质体融合)、胚胎培养以及植物体外受精技术可获得远缘杂交种，通过植物组织培养中的茎尖培养能够产生无病毒原种，因而可用于植物脱毒，解决生产实践中植物病毒危害问题，组织培养是植物细胞工程学、遗传学、植物生理学、生物化学与分子生物学研究的重要基础，不仅用于快速繁殖。还用于单倍体育种、种质保存、生理学研究和基因转化等领域。
早在上世纪80年代，高天舜就利用羊草根茎作为外植体进行愈伤组织的诱导和植株再生材料，目的是为了改良羊草的遗传性状，试图通过组织培养途径获得羊草新类型，该研究采用当年生羊草根茎幼嫩部分的节间基部切段以及隔年生老根茎和当年生根茎的芍间中部、顶部切段作为外植体，消毒处理后接种于3种MS培养基中，先进行暗培养。待长出愈伤组织后转入光照培养，诱导率平均在20％左右，分化率最高也只有24.2％，羊草幼穗和成熟种子也可作为诱导愈伤组织的外植体，刘公社等，以幼穗作为外植体，恒温25℃条件下诱导愈伤组织，在加有1mg/L2，4-D MS培养基上继代2次后，转移到含1.0mg/L KT和0.5mg/NAA的MS培养基上分化培养得到再生芽，并在无激素的基本培养基上获得了生根的试管苗，移栽到温室后可正常生长，尽管从羊草叶片、幼穗和成熟胚在同样培养条件下均能诱导出愈伤组织，但只有幼穗愈伤组织能够继续分化出再生植株，但分化率因基因型和外源激素的不同而不同，以成熟羊草种子为外植体诱导愈伤组织具有操作简便、污染程度低、材料选择直观化的优点，且诱导率和幼苗分化率较高、幼苗健壮、生长势好，崔秋华等采用3种培养基(MS、B5和8114)，3种2，4-D的浓度水平(1、2、4 mg/L)培养羊草幼嫩根茎和种子，结果表明，以种子作为外植体可获得较高的愈伤组织诱导率(29.05％)，但目前对于最适激素浓度没有统一结论，其范围从1～4mg/L不等，对愈伤组织的诱导效果也未达到令人满意的水平，仍需要深入研究。
在对羊草愈伤组织的应用方面，可以以羊草种子诱导出的愈伤组织为材料，用含有NaCl的培养基和含有NaHCO3与Na2CO3的混合盐培养基进行培养，测定羊草愈伤组织的耐盐性，结果表明羊草愈伤组织对NaCl最大耐受强度为180mmol/L；对NaHC03与Na2CO3的混合盐的最大耐受强度为4mmol/L中性盐(NaCl)与碱性盐(NaHCO3与Na2CO3)对羊草愈伤组织的胁迫机制明显不同，国内外对于愈伤组织的培养大多应用于转基因，但在羊草方面进行的该项研究却很少，刘公社将携带PAT基因的质粒通过基因枪法转化羊草愈伤组织。然后在筛选培养基上进行培养，筛选抗性愈伤组织并转接到分化培养基上，得到再生苗，然后接种到含有筛选剂的生根培养基上培养后得到转基因羊草小苗，该研究已获得耐除草剂的羊草新品种专利，曲同宝等用基因枪将BADH基因转入由羊草成熟胚诱导出的胚性愈伤组织中，获得了转基因植株，经过PCR检测证明外源基因已整合到羊草基因组中并得以表达，虽然转入羊草的基因都可被检测到已整合人羊草基因组中，而且也得到表达，但是对于转基因羊草对周围生态环境的影响还未见相关报道，筛选突变体是羊草愈伤组织的另一用途，陈晖等用组织培养方法筛选获得羊草抗羟脯氨酸(HYP)变异系HR20-8，该变异系细胞内游离氨基酸和蛋白质组分氨基酸含量均发生了较大的变化，与供体对照比较，分别提高2.35倍和1.40倍，其中，游离脯氨酸和蛋白质组分脯氨酸分别提高6.6倍和3.0倍，且脯氨酸合成途径必需的r-谷氨酸激酶的活性提高了2.5倍。
3 羊草酶蛋白类研究
蛋白质是生物体生命中的第一重要物质，是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，同时能够调控相关基因的表达，植物对抗非生物胁迫必然有蛋白质的参与，比如耐冷蛋白、热休克蛋白、水通道蛋白、赤霉素信号传导蛋白等，从羊草中检测这些蛋白的含量以及克隆表达该蛋白的基因对于研究羊草耐逆分子机理和改善羊草品质都具有重要意义。
目前对于羊草酶蛋白的研究还远远不够，主要有细胞色素氧化酶、过氧化物酶、脂酶同工酶等，其应用也仅局限于阐明羊草的遗传分化，通过聚类分析可以研究羊草种群在不同地理及生态环境中羊草在分子水平上细胞色素氧化酶同工酶存在着种内分化，羊草在同工酶水平上的分化受多个环境因子的综合影响，而且与羊草耐寒性能存在一定的内在联系，张丽萍等对采自同一天然草地上叶片呈黄绿色、灰绿色两种类型羊草的根、茎、叶的过氧化物同工酶、脂酶同工酶进行了分析比较，结果表明，两种叶色羊草，其相同组织的过氧化物同工酶谱及脂酶同工酶谱基本一致，两种羊草叶片呈现不同颜色只属不同生态型，
磁场处理不仅可以促进羊草的生长。而且还能提高羊草的抗盐碱性，磁场使羊草过氧化物酶(POD)活性提高，并且诱发了一条新的同工酶带，张卫东等认为羊草自交不孕的原因是自交不亲和。并利用禾本科植物自交不亲和性有关的硫氧还蛋白(thsioredoxin)^基因设计的引物在羊草DNA中检测到预期片段，说明硫氧还蛋白h基因可能与羊草的自交不亲和性有关，该基因现已被克隆并能够从GenBank中查到其序列。
研究羊草草原土壤酶的活性可以判断土壤的肥力，土壤肥力水平接近则土壤酶的活性相似，土壤蛋白酶、脲酶、多酚氧化酶的活性与土壤有机碳、全氮呈显著相关关系，可以反映土壤肥力水平高低，是评价土壤退化的重要指标。
4 羊草耐逆基因的分离与克隆
羊草具有耐寒、耐旱、耐盐碱的特性，并且蛋白质含量较高，说明羊草在面对非生物胁迫时高效表达能够适应、缓解或对抗相应逆境条件的物质，尤其是调控这些物质表达的酶类基因，据报道，羊草种子个体萌发期最大忍受pH范围是9.14-9.53，对于NaCl可耐受的最大强度为600mmol/L，对于Na2C03可耐受的最大强度为175mmol/L，为了弄清这种适应机制的复杂性，通过大规模的cDNA克隆或者表达序列标签(EST)的测序分离相关基因是非常重要的，Jin等采集自然生长的植物叶组织经过Na2CO3胁迫处理构建了cDNA文库，并对其EST进行测序对比分析，推断在羊草叶和根中各有39和31个非生物胁迫相关基因，这些EST资源将有助于对植物耐盐碱分子基础的深入研究和理解。
甜菜碱是在生物体内起着渗透保护作用最主要的细胞相溶性物质，编码决定该物质合成的关键酶一甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因已经先后从多种生物体内得到克隆，并在多种植物中进行了遗传转化。已获得了抗盐、抗寒、耐旱能力得到较大程度提高的转基因植株，某些植物体内的甜菜碱含量和BADH活性随着土壤盐碱化程度的加重而增加，因此推测甜菜碱可能与羊草耐盐碱性有关，目前羊草中的部分BADH基因片段也已经被成功克隆。
5 问题与展望
0 引言
肝干细胞的可塑性及其分化机制的研究在基础理论和临床应用等方面均有重要意义。一方面，肝干细胞可能参与肝脏损伤的修复与重建，研究肝干细胞的分化机制有助于阐明肝脏的发育机制；另一方面，肝干细胞分化为具有功能的成熟肝细胞，将为肝细胞移植和生物型人工肝提供重要的细胞来源。同时，阐明这些问题也可为临床肿瘤等疾病的基因治疗提供新的治疗手段[1]。肝干细胞分化过程和机制较为复杂，关于肝干细胞分子机制的研究成为肝干细胞研究的重要方面，现将其进展做一综述。
肝干细胞的基本特征可概括为两点：(1)具有双向分化能力，可向肝细胞和胆管细胞分化；(2)具有自我更新能力。目前肝干细胞范畴的界定还比较混乱，但较为一致的观点是：卵圆细胞(oval cell)、胎肝细胞、小肝细胞和骨髓造血干细胞都是肝干细胞的候选者。
1 卵圆细胞
肝脏受损后的再生一般情况下由肝实质细胞分裂增殖来完成，而当肝实质细胞严重受损不能增生或受到有丝分裂原抑制剂损伤时，位于肝内低分化的卵圆细胞即被激活，进一步增殖、分化为肝细胞和胆管细胞来完成肝脏的结构与功能重建，卵圆细胞的形态学和免疫组织化学方面与胆管上皮细胞相似，形态呈卵圆形。有学者[2]建立了一种新的促肝脏卵圆细胞增殖的小鼠模型，研究发现，这种卵圆细胞在表达Scal、CD34及CD35的同时，还表达A6及AFP，说明Scal、CD34及CD35是小鼠肝卵圆细胞的特异标志。由于目前尚未发现肝干细胞的特异性表面标志，故有关肝干细胞的分离纯化仍不成熟，近来有人[3]利用绿色荧光蛋白转基因小鼠的肝细胞的荧光活性纯化并富集肝干细胞，并发现CD45(-)TER-ll9(-)AFP(+)的高表达GFP的幼稚细胞，具有增殖分化潜力，可以分化为肝细胞和胆管细胞。TNF在肝干细胞的活化及肿瘤的发生中有重要作用。研究者[4]观察到，在缺乏胆碱而补充乙硫氨基酪酸饮食的大鼠卵圆细胞增殖中，TNF具有正调节作用，同时卵圆细胞本身也表达TNF。在TNFIR基因敲除小鼠，卵圆细胞的增殖被大大削弱，肿瘤的形成明显减弱。生长因子受体酪氨酸激酶信号在正常肝细胞生长的调节中有重要作用，研究发现[5]受体型酪氨酸激酶家族中Tie2、cMet、Flk1在实验性大鼠肝癌细胞中比正常肝细胞中显著增高。其中后两者在GSTP(+)的癌前病变中过量表达，而Tie2在内皮细胞和卵圆细胞上有表达，考虑Tie2、cMet、Flk1与肝癌的发生有关。在人类肝脏，卵圆细胞的数量随肝损伤的加重而增多。这种卵圆细胞的增生是肝干细胞对肝损伤的反应而不是受损肝细胞的管样化生[6]。
2 胚胎肝细胞
有人[7]将胚胎13.5天的胎肝细胞用绿色荧光蛋白(EGFP)标记，移植入小鼠肝中，结果发现移植后胎肝细胞AFP的表达逐渐降低，而ALB的表达逐渐升高。为了了解肝脏发育过程中肝干细胞标志的表达情况，有学者[8]选用干细胞标志Thy1和肝细胞标志CK18进行研究，分别选取胚胎第16、18、20天及新生大鼠的肝脏，分离提取肝细胞，采用磁珠分离法纯化胎肝细胞，结果发现，在磁珠分离前，所有的胎肝细胞均表达Thy1，磁珠分离后，仅在部分胎肝细胞表达Thy1，而CK18在磁珠分离前后的胎肝细胞上均表达，说明在胎肝中有不同的肝细胞群同时存在，其中一部分具有干细胞特征。有学者[9]成功分离人胎肝上皮细胞，在体外培养数月后，通过门静脉移植入小鼠肝脏，在移植后一小时，小鼠肝脏中有1.5%的移植细胞，继而发现14%～55%的移植细胞进入小鼠肝脏，移植细胞占小鼠肝脏细胞总数的1%。
3 小肝细胞
小肝细胞其形态与成熟肝细胞相似，有较小的嗜碱性核，胞质中有空泡，有丰富的线粒体、粗面内质网和糖原颗粒，表达胎肝母细胞、卵圆细胞和成熟肝细胞的部分分化标志，但又与这些细胞不尽相同。在惹卓碱处理的大鼠，2/3肝切除后的前5天，增殖的小肝细胞表达ALB、转铁蛋白、H4抗原、OC2和OC5，但不表达OV6、OC4、OC10。2/3肝切除后7天小肝细胞的分化标志即与完全分化的肝细胞相似。所以小肝细胞被认为是不同于肝母细胞、卵圆细胞和完全分化肝细胞的一种独立的有干细胞功能的细胞群。有学者[10]研究发现，在肝切除后3～7天，小肝细胞表达的肝脏富集的转录因子的水平与成熟肝细胞表达的转录因子的水平完全不同，且小肝细胞不表达酪氨酸转氨酶和α抗胰蛋白酶，而表达WT1和AFP的水平反而增加，在肝切除后14天，除AFP外，小肝细胞表达的其他细胞分化标志与完全分化的肝细胞相类似。此外他们还认为，早期出现的小肝细胞不表达细胞色素P450，而在细胞色素P450的作用下，惹卓碱被代谢为有丝分裂抑制剂，因此小肝细胞有抗惹卓碱毒性的作用。
4 骨髓造血干细胞
近年发现成年个体的造血干细胞可塑性很大，可以分化为所有种类的组织细胞。有学者[11]首先在大鼠中发现一些骨髓细胞来源的卵圆细胞和肝细胞，研究者将雄性大鼠的骨髓细胞移植入经放射线致死照射的雌性大鼠，然后用2-乙酰氨基芴和四氯化碳损伤此受体鼠，此后在受体鼠的肝脏中发现了Y染色体阳性的卵圆细胞和肝细胞。有学者[12]对骨髓来源肝干细胞研究发现，Thy1(+)、β2微球蛋白(-)的骨髓细胞能分化为形态和功能都与肝实质细胞相同的细胞，分化细胞在超微结构上与肝实质细胞完全相同，而且在大鼠及人的正常肝脏及病肝中也可发现Thy1(+)、β2微球蛋白(-)细胞的存在。所以Thy1(+)、β2微球蛋白(-)的骨髓细胞被认为具有肝干细胞的特征。
骨髓中造血干细胞一方面可以在病肝中分化为肝实质细胞，从而恢复肝功能，一方面又可以作为肝病基因治疗的载体。美国研究者[13]将大鼠异体骨髓造血干细胞和成熟肝细胞分别通过门静脉注射入原位肝移植后发生排斥反应的大鼠肝脏，结果发现骨髓造血干细胞中约62%的细胞定位于肝脏，而成熟肝细胞只有约2.5%定位于肝脏，而且移植的造血干细胞表现出肝细胞和胆管细胞的特征。有学者[14]报道人骨髓中的造血干细胞也可以分化为肝细胞，用DNA特异性探针在一曾接受男性骨髓移植的女性病人肝脏中发现有Y染色体阳性的肝细胞，而将曾接受男性骨髓移植的女性病人肝脏再移植给另一男性患者，结果在被移植的肝组织中发现有Y染色体阳性的肝细胞，提示骨髓造血干细胞可以定位于肝脏并分化为肝细胞。
转贴于 5 肝干细胞的分化机理
肝干细胞的分化是一个复杂的过程，肝干细胞是维持自我复制还是分化为成熟的功能细胞依赖于微环境、细胞生长因子等多种因素的相互作用与平衡。具体来说，肝干细胞分化与增殖的调控因素主要有：（1）时钟，它通过改变细胞周期促进因子或抑制因子的水平，决定干细胞的分裂次数。如Cul1蛋白是一种细胞周期促进因子，它与细胞周期蛋白G1的破坏有关。p27是一种抑制因子，它促进干细胞分化并抑制其增殖。（2）微环境，有学者[15]将肝卵圆形细胞移植到大鼠肝组织时，卵圆形细胞分化成为肝实质细胞，卵圆形细胞经皮下移植时常常形成易转移和分化程度低的肿瘤，其原因可能是皮下基质抑制卵圆形细胞分化为肝细胞，因而促进瘤生物的形成。（3）生长因子和细胞外基质，它们在肝干细胞分化为肝实质细胞的过程中有重要作用。有学者[16]报道，肝细胞生长因子(HGF)可诱导白蛋白阴性的肝干细胞转变为白蛋白阳性的肝祖细胞。
6 小结与展望
综上所述，有关肝干细胞活化、分离培养、筛选及鉴定等尚未成熟，肝干细胞的研究有待进一步发展和完善，可以肯定的是其分子机制的研究将是未来研究的主要内容，而肝干细胞与肿瘤发生的关系以及肿瘤干细胞相关治疗将是研究的一个重要方面。
参考文献
［1］ Blau HM， Brazelton TR， Weimann JM. The evolving concept of a stem cell: entity or function?[J]. Cell， 2001， 105(7): 829841.
[2] Petersen BE， Grossbard B， Hatch HO. Mouse A6positive hepatic oval cells also express several he matopoietic stem cell markers[J]. Hepatology， 2003， 37(3): 632640.
[3] Fujikawa T， Hirose T， Fujii H. Purification of adult hepatic progenitor cells using green fluorescent protein(GFP)transgenic mice and fluorescenceactivated cell sorting[J]. J Hepatol， 2003， 39(2):162167.
[4] Knight B， Yeoh GC， Husk KL. Impaired preneoplastic changes and liver to mor tbr mation in tumor necrosis factor receptor type 1 knockout mice[J]. J Exp Med， 2000， 192(12):18091818.
[5] Kuroda H， Ohtsuru A， Futakuchi M. Distinctive gene expression of receptortype tyrosine kinase families during rat hepatocarcinogenesis[J]. Int J Mol Med， 2002， 9(5):473480.
[6] Lowes KN，Brennan BA， Yeoh GC， et al.Oval cell numbers in hu mzn chronic liver diseases are directly related to disease severity[J]. Am J Pathol， 1999， 154(12):13131323.
[7] Cantz T， Zuckerman DM， Burda MR. Quantitative gene expression analysis reveals transition of fetal liver progenitor cells to matune hepatocytes after transplantation in u P A/ RAG 2 mice[J]. Am J Pathol， 2003， 162(1):3745.
[8] Fiegel HC， Park JJ， Lioznov MV. Characterization of cell typesduring rat liver development[J]. Hepatology， 2003， 37(1):148154.
[9] Malhi H， Irani AN， Gagandeep S， et al. Isolation of human progenitor liver epithelialcells with extensive replication capacity and differentiation into mature hepatocytes[J]. J Cell Sci， 2002， 115(5):26792688.
[10]Sandler RS， Cummings MS， Keku TO. Disposable versus reusable biopsy forceps for colorectal epithelial cell proliferation in humans[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2000， 9(10):11231125.
[11]Petersen BE， Bowen WC， Patrene KD， et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells[J]. Science， 1999， 284(4):11681170.
[12]Itzhak A， Daniel I， Takeshi A. Isolation， characterization， and transplantation of bone marrowderived hepatocyte stem cells[J]. Biochenical and Biophysical Communications， 2001， 288(3):156164.
[13]Avital I， Feraresso C， Aoki T， et al. Bone marrow-derived liverstem cell and maturehepatocyte engraft ment in livers undergoing rejection[J]. Surgery， 2002， 132(2):384390.
[14]Theise ND， Nimmakalu M， Gardner R， et al. Liver from bone marrow in humans[J]. Hepatology， 2000， 32(1):1116.
[15]Grisham JW， Coleman WB， Smith G J. Isolation， culture， and transplantation of rat he pat ocytic precursor( stemlike) cells[J]. Proc Soc Exp Biol Med， 1993， 204 (3): 270279.
[关键词] 分化型甲状腺癌；分子生物学；进展
[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）09（b）-0019-03
甲状腺癌主要组织病理学类型包括状癌（PTC）、滤泡状癌（FTC）、髓样癌（MTC）以及未分化癌（ATC）。前两者统称分化型甲状腺癌（DTC），共占甲状腺癌的90%以上，占头颈部恶性肿瘤的首位，占所有恶性肿瘤的3%，女性发病率较高。近20年来，我国甲状腺癌发病率呈明显上升趋势，由约1/10万上升到（3～4）/10万。DTC确切的致病因素尚不清楚，幼年时过量射线照射是目前唯一确定的致癌机制[1-2]。近年来分子生物学技术研究使人们对甲状腺癌的分子机制有了更深入的了解，这对于指导甲状腺癌的诊断治疗及疗效评价有非常重要的意义，本文就DTC相关基因研究进展进行综述。
1 BRAF基因
BRAF基因最早是在人类尤文肉瘤中发现的高度表达变异的癌基因，在极少数的胃肠癌、肺癌、卵巢癌以及甲状腺癌等多种肿瘤中都有表达[3]。BRAF又名鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，该基因位于第7号染色体，为RAF基因家族成员之一，是RET和RAS的下游信号分子。目前认为，BRAF基因突变是甲状腺癌最常见的基因变异之一，约49%的PTC和25%的ATC会出现该基因的表达[4]。其发生机制为BRAF基因错义突变的15外显子碱基，致使翻译蛋白质600位密码子将对应的缬氨酸 （V600E）替代为谷氨酸，可活化蛋白激酶，并进一步激活ERK激酶，向MAPK信号通路下游传递细胞有丝分裂信号，致使甲状腺细胞肿瘤形成并向恶性转化[5]。
BRAF基因突变是近年来甲状腺癌基因领域的重要研究进展，也是目前针对DTC发生机制研究最多的突变类型之一。最近研究显示导致激酶激活突变的因素有多种，包括点突变框内插入或框内缺失、放射线暴露等，尽管其发生率较低。由于BRAF基因突变在DTC中发生率较高，而在甲状腺良性病变中检测不到，因此该突变可以作为特异性较强的DTC诊断指标。该突变与低分化的甲状腺癌及ATC的变异性也有较强关联性，在高细胞及经典亚型的PTC中更为常见。还有研究显示该突变的存在似乎与肿瘤的侵袭性特征有关，此突变可使肿瘤更易去分化，因为此突变可见于间变性转化，如甲状腺包膜外侵犯、远处转移和肿瘤复发，而这类因素往往代表着较高的肿瘤相关死亡率。一些大样本临床研究证实，腺体外浸润、区域淋巴结转移、TNM分期（Ⅲ/Ⅳ期）均与BRAF突变呈正相关[6]。有研究对PTC患者随访显示高达80%～85%的复发PTC伴有BRAF突变，这证明对于PTC复发，BRAF突变有很强的预测作用。
以BRAF以及其下游激酶为靶点的分子靶向药物治疗已成为目前DTC治疗研究的又一热点。近年来研究显示多靶点激酶抑制剂索拉非尼（sorafenib）能抑制BRAF突变基因型的甲状腺肿瘤细胞和甲癌肿瘤模型的增殖和生长，但目前国内尚未见该药用于甲状腺癌治疗的报道[7]。
2 RET/PTC重排基因
RET基因于1985年首次发现于小鼠转化的NIH3T3细胞中，因其同样具有与其他基因重排及活化的特征，故又称为RET原癌基因。RET原癌基因经重排后被称为RET/PTC癌基因，属于酪氨酸蛋白激酶受体家族。在这些RET/PTC重排中，RET基因的跨膜区和细胞外区丢失，取而代之的是不同基因来源的5′末端，例如RET与H4融合形成RET/PTC1嵌合体，与RIalpha融合形成RET/PTC2嵌合体等。其产生的嵌合体使RET原癌基因编码的酪氨酸蛋白激酶发生激活，通过下游信号的传导使甲状腺滤泡上皮细胞发生恶性转化[8]。目前研究指出，甲状腺的免疫功能通过RET/PTC1下调，可间接促进PTC的发生。提示癌基因、免疫、炎症及恶性肿瘤生物学特性之间存在一定联系，在甲状腺癌发病机制中RET/PTC基因重排有较重要的作用。
在PTC细胞中RET/PTC基因重排普遍存在，而在正常甲状腺组织及良性甲状腺病变中不表达或基本不表达[9]，所以RET/PTC重排可以作为诊断PTC较特异的指标。但PTC中RET/PTC的表达率报道不一，所以其阴性结果并不能完全除外PTC。此外，国外研究还发现放射性暴露史能引起RET/PTC基因重排并进一步促使甲状腺癌的发生。国外学者报道幼年时曾有放射线暴露史的PTC患者的RET/PTC重排发生率明显高于无此经历的PTC患者[10]。还有作者对在切尔诺贝利核泄露事故中受过量射线照射所致的状甲状腺癌患者进行分子生物学分析也发现上述特点。
对于有无RET/PTC重排及与PTC的临床特征之间的关系，目前临床认为存在RET/PTC重排的PTC患者的TNM分期更晚，也更易表现出甲状腺被膜外侵犯，也更易复发。但由于采集病例数较少以及所采用的免疫方法不同，在不同的国家和地区，其阳性率相差也比较大，为2.5%～53.5%。还有证据显示是否存在RET/PTC重排与甲状腺状癌的不同生物学行为特点有关，有RET/PTC2重排的分化型甲状腺癌往往具有高度的侵袭性和去分化能力[11]。国外Zafon等[12]报道 RET/PTC表达阳性的甲状腺状癌患者更易发生局部浸润及淋巴结转移，两者差异有统计学意义（P
舒尼替尼（sunitinib）为近年研制的一种多靶点受体拮抗剂，可以明显抑制RET/PTC酪氨酸激酶[13]。在另一项研究中，舒尼替尼可抑制具有RET/PTC1重组的PTC增殖和生长，但目前国内亦尚未用于甲状腺癌的临床治疗。
3 RAS原癌基因
RAS是一种原癌基因，广泛存在于人和动物细胞中，为人类多种肿瘤最常见的基因异常。RAS基因包括K-RAS、H-RAS和N-RAS 3种类型，这三种基因内结构分别很大，但都编码一种结构相似的G蛋白质，分子量为21 kD，故统称为P21-RAS[14]。分子生物学及遗传学研究提示，RAS基因是存在于细胞膜上一种鸟嘌呤核苷酸的结合蛋白，为多种酪氨酸激酶受体的感受器，并细胞的生长及分化起调解作用。该基因一般有两种存在方式，即与GDP结合时的失活状态以及与GTP结合时的活化状态。突变的RAS蛋白降低了自身内源性鸟苷酸三磷酸酶（GTP）的活性，其结果是致使GTP与RAS蛋白的持续结合并具有了促使细胞生长的作用，致使RAS处于一种持续激活的状态中。由于酪氨酸激酶受体等多种信号传导通道的传感器都受该基因编码联系，并可激活多个不同信号传导通道，其结局会导致甲状腺组织细胞转化为恶性。
RAS突变常在特定肿瘤中出现，如RAS突变可见于95%的胰腺癌中。它也是DTC中检测到的最常见的突变之一。不同的肿瘤有不同的RAS基因突变类型，如K-RAS突变与肺癌有关等。DTC中已经检测到多种RAS基因突变如N-RAS、K-RAS、H-RAS，但在MTC组织中几乎从未检测出该基因突变。该基因突变主要存在于滤泡型PTC及滤泡性腺瘤中，但FTC少见[15-16]，该基因突变还对滤泡性腺瘤能否进一步发展为腺癌或者未分化癌具有一定的预测意义，为RAS阳性的腺瘤积极手术切除提供依据。大约10%的FTC可见RAS基因的点突变，并且似乎仅与滤泡亚型FTC有关。RAS点突变型FTC往往伴有滤泡变异型组织学的特性，表现为肿瘤外侵、肿瘤的失分化和出现转移，这在存在骨转移的病例中表现尤为明显[17]。而在低分化DTC组织中往往RAS突变检出率较高，表明该突变会导致DTC更强的侵袭能力。
RAS突变是在DTC中比较多见的事件，具有较高的特异性和敏感性。RAS突变和这些肿瘤的预后及临床特征密切相关，作为一种DTC的诊断学标志具有较广阔的发展前景。RAS抑制剂洛伐他汀已被证实在RAS突变的的甲状腺肿瘤的体内具有抗肿瘤效果[18]，为RAS突变表达的DTC提供了新的治疗方法，可能对限制肿瘤的播散有作用，这还需要临床进一步研究。
综上所述，多种免疫组化结果与DTC的发生、发展、预后和转归有密切关系，而且，每种基因的作用均有所不同。甲状腺标本检测P21-RAS有助于分化型甲状腺癌的诊断，而进行RET/PTC及BRAF检测，不但可以有助于诊断PTC，而且可更好地估计肿瘤的侵袭性及淋巴结转移特点，对于肿瘤的后续治疗方案（如分子靶向治疗等）及判断预后有重要价值。
[参考文献]
[1] Nikiforov Y E.Molecular diagnostics of thyroid tumors[J].Arch Pathol Lab Med，2011，135（24）：569-577.
[2] Hamatani K，Eguchi H，Ito R，et al. RET/PTC rearrangements preferentially occurred in papillary thyroid cancer among atomic bomb survivors exposed to high radiation dose[J].Cancer Res，2008，68（17）：7176-7182.
[3] Ikawa S，Fukui M，Ueyama Y，et al.B-raf，a new member of the raf family，is activated by DNA rearrangement[J].Mol Cell Biol，1988，8（6）：2651-2654.
[4] Watanabe R，Hayashi Y，Sassa M，et al. Possible involvement of BRAF V600E in altered gene expression in papillary thyroid cancer[J].Endocr J，2009，56（3）：407-414.
[5] Oler G，Camacho CP，Hojaij FC，et al.Gene expression profiling of papillary thyroid carcinoma identifies transcripts correlated with BRAF mutational status and lymph node metastasis[J].Clin Cancer Res，2008，14（15）：4735-4742.
[6] Kebebew E，Weng J，Bauer J，et al.The prevalence and prognostic value of BRAF mutation in thyroid cancer[J].Am Surg，2007，246（3）：466-470.
[7] Lam ET， Ringel MD， Kloos RT，et al. PhaseⅡclinical trial of sorafenib in metastatic medullary thyroid cancer[J].J Clin Oncol，2010，28（14）：2323-2330.
[8] KodamaY，Asai N，KawaiK，et al.The RET protooncogene：a molecular therapeutic target in thyroid cancer[J].Cancer Sci，2009，96（3）：143-148.
[9] Nikiforova MN，Nikiforov YE. Molecular genetics of thyroid cancer：implications for diagnosis， treatment and prognosis[J].Expert Rev Mol Diagn，2008，8（1）：83-85.
[10] Hamatani K，Eguchi H，Ito R，et al. RET/PTC rearrangements preferentially occurred in papillary thyroid cancer among atomic bomb survivors exposed to high radiation dose[J]. Cancer Res，2008，68（17）：7176-7182.
[11] Nikiforov YE.RET/PTC rearrangement in thyroid tumors[J].Endocr Pathol，2012，13（1）：3-16.
[12] Zafon C，Obiols G，Castellvl J，et al.Clinical significance of RET/PTC and p53 protein expression in sporadic papillary thyroid carcinoma[J].Histopathology，2007，50：225-231.
[13] Torino F，Paragliola RM，Barnabei A，et al. Medullary thyroid cancer：a promising model for targeted therapy[J]. Curr Mol Med，2010，10（7）：608-625.
[14] Missero C，Pirro MT，Di Lauro R.Multiple RAS downstream pathways mediate functional repression of the homeobox gene product TTF-I[J]. Mol Cell Biol，2000，20（8）：2783-2793.
[15] Esapa CT，Johnson SJ，Kendall-Taylor P，et al. Prevalence of RAS mutations in thyroid neopiasia[J]. Clin Endocrinol（Oxf），1999，50（4）：529-535.
[16] Suarez HG，du Villard JA，Severino M，et al. Presence of mutations in all three RAS genes in human thyroid tumors[J].Onco gene，1990，S（4）：565-570.
[17] Garcia-Rostan G，Zhao H，Camp RL，et al. RAS mutations are associated with aggressive tumor phenotypes and poor prognosis in thyroid cancer[J]. J Clin Oncol，2003，21（17）：3226-3235.
1 DMBT1基因的发现与分子结构特征
1997年，Molleuhancer等[1]研究发现80%的多形性胶质细胞瘤显示具有10q的缺失。并采用表象差异分析法在一个成神经管细胞瘤细胞株中，识别了一个位于10q25．3-26．1的纯合子缺乏，并克隆了跨越这一缺失的新基因--DMBT1基因。正是由于最早发现该基因常常在脑组织恶性肿瘤中丢失，故而得名（deleted in m alignant brain tumors，DMBT1）。
DMBT1基因位于10号染色体长臂，由高度同源的重复外显子和内含子序列构成[2]，该基因具有至少54个外显子，并且覆盖长达8 kb的基因组区域[3]。 DMBT1基因与清道夫受体富含半光氨酸区域（SRCR）超家族具有同源性，编码包含SRCR区,CUB(“Clr/Cls Uegf Bmp1”)区和ZP(“zona pellucida”)区[4]的糖蛋白。因此也说明DMBT1可能参与间接的蛋白与蛋白的相互作用。
2 DMBT1基因的功能
2．1 DMBT1与免疫防御 DMBT1编码蛋白是SRCR超家族中的新成员，SRCR超家族是免疫球蛋白超家族中具有回忆功能且大多数与免疫系统的增生和分化相关的家族[5]。Mollenhauer等[5]研究发现DMBT1 mRNA在整个免疫系统都有表达，Western杂交研究显示DMBT1同源体与胶原凝集素结合蛋白gp-340相符合，gp-340是一种参与呼吸道免疫防御的糖蛋白，DMBT1 gp-340通过与肺泡表面的表面活性蛋白Sp-D（surfactant protein D）、Sp-A作用可刺激肺泡巨噬细胞的迁移。免疫组化显示肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤细胞都可以合成DMBT1,而且在多形性胶质母细胞瘤中（与正常脑组织相比）下调，其可能参与了免疫防御功能。
2．2 DMBT1与细胞分化 据Hikitac等[6]和Al-Awqati等[7]研究报道hensin这种蛋白存在于远曲小管和集合管的闰上皮细胞以及小肠上皮细胞，是一种极性蛋白质，调节细胞内外基质的相互作用及与细胞表面蛋白的联系而能够逆转上皮细胞的极性，而集合小管闰细胞的极性转变代表了终末分化；hensin这种蛋白还能诱导微绒毛蛋白的表达，而导致尖端终端网状蛋白（细胞角蛋白19和肌动蛋白）的出现（这些均导致过度生长的微绒毛结构）。Hensin在许多类型的上皮细胞中表达，而且可能它在这些上皮细胞的分化中也扮演了相同重要的作用。兔的hensin蛋白和人的DMBT1蛋白均来源与相同基因的选择性拼接。免疫组化显示DMBT1蛋白在成人与胎儿的胃肠道上皮细胞、表皮细胞的表达水平和空间分布存在明显差异，这提示DMBT1可能在人体某些部位的发育过程起作用。说明DMBT1可能具有促进细胞分化的功能。
3 DMBT1表达与肿瘤临床病理、生物学行为
Mollenhauer等[1]通过RNA 转移杂交在胎儿肺中检测到DMBT1的cDN段有8．0、7．5、6．0 kb 3种，在成人肺中只检测到8．0 kb片段，在小肠中检测到7．5 kb和6．0 kb片段。比较DMBT1基因6．0 kb片段和 8．0 kb片段的外显子功能，Mollenhauer等发现DMBT1的不同大小片段可编码不同SRCR区和SID区（SRCR interspersed domain）的蛋白质，且SRCR区是蛋白配体的结合区。还发现在8．0 kb片段中外显子14（定位于SID3a）及外显子17（定位于SID4b）缺乏，提示可能是编码SID区的外显子功能的不同调控方式，进一步提示不同的编码外显子的SRCR区和SID区可产生不同功能特点的蛋白质。DMBT1基因在正常成人呼吸系统和消化系统组织中高表达[8-9]，在生殖系统和脑组织中为中等表达，在多种肿瘤中，DMBT1基因的表达与淋巴结转移、肿瘤浸润深度存在明显的相关性，伴有淋巴结转移的肿瘤，DMBT1基因的表达率低于无淋巴结转移者。DMBT1基因表达的改变与肿瘤的组织学分型、浸润方式、肿瘤大小、肿瘤部位等无关。
4 DMBT1基因在常见肿瘤的表达及其与肿瘤发生、发展、浸润、转移的关系
大量的研究显示DMBT1基因和/或表达的异常与神经系统肿瘤、消化系统肿瘤、肺癌、乳腺癌等均有关，以下就DMBT1基因与肿瘤的关系作一简要阐述。
4．1 DMBT1基因在神经系统肿瘤中的表达 Mollenhauer等[1]研究发现，在20例成神经管细胞瘤有5例，39例多形性胶质母细胞瘤中有19例检出等位基因的缺失，同时发现在二者中存在高比例的纯合性缺失，且4/5脑肿瘤细胞株缺乏DMBT1基因的表达，故认为DMBT1可能是一种参与成神经管细胞瘤和多形性成胶质细胞瘤致癌机制的肿瘤抑制基因。Somerville等[10]研究指出：21例原发性胶质母细胞瘤中38%肿瘤显示DMBT1基因内的纯合性缺失。Lin等[11]研究报道，在26例间变性少突胶质瘤、31例间变性星形细胞瘤、53例多形性胶质母细胞瘤中，DMBT1位点常常发生杂合性缺失，且3组之间无明显差异，但DMBT1位点的杂合性缺失与患者的生存期无关，认为DMBT1与胶质瘤形成的早期阶段有关。但是据Sanson等[12]研究报道，39例少突胶质瘤中，10例出现DMBT1基因纯合性缺失，但这其中只有1例具有PTEN突变，且其纯合性缺失与生存期无关，认为DMBT1基因有关肿瘤发生的作用有待进一步研究证明。
4．2 DMBT1基因在消化系统肿瘤中的表达 DMBT1在正常成人消化系统呈高水平表达，Mori等[13]用RT-PCR的方法测定食管癌、胃癌、结直肠癌中DMBT1 mRNA的表达，发现43例食管癌中有23例、40例胃癌中有5例、24例结直肠癌中4例DMBT1 mRNA的表达明显减少。且15种食管癌细胞系中12种食管癌细胞系无DMBT1 mRNA表达，并且11．6%原发性食管癌中、
13．3%食管癌细胞系中存在DMBT1纯合性缺失。表明DMBT1作为一个肿瘤抑制基因也存在于消化道肿瘤中，特别是食管癌中。王越英等[14]研究报道，在食管癌、贲门癌、胃癌组织中，DMBT1 mRNA阳性表达缺失率分别为63．2%（24/38）、52．4%（11/24）、72．0%（18/25）。伴有淋巴结转移的癌组织DMBT1 mRNA表达缺失率均显著高于相应淋巴结无转移的癌组织，肿瘤外侵越严重，DMBT1 mRNA表达缺失率越高，提示DMBT1基因在上消化道癌的发生、发展及转移中起一定作用。
Sasaki等[15]检测了25例肝结石病的胆管上皮、52例伴有肝结石病的浸润和非浸润肝内胆管细胞癌、49例伴有肝结石病的肝管内状瘤、32例无肝结石病的肝内胆管细胞癌和10例正常肝组织。发现与正常的肝组织相比肝结石病的胆管上皮的DMBT1表达增加，57%的伴有肝结石病的肝管内状瘤和79%的非浸润性肝内胆管细胞癌表达也增加，而有和无肝结石病的浸润性肝内胆管细胞癌的DMBT1表达减少（各为50%和30%）。在4个（20%）肝管细胞癌组织和2个（50%）胆管细胞癌细胞株存在纯合性缺失和表达减少，故认为DMBT1基因纯合性缺失和表达减少是肝内胆管细胞癌形成和进展的关键。
4．3 DMBT1基因在肺癌组织中的表达 据Wu等[9]研究报道，10%（2/20）小细胞肺癌细胞系和43%（6/14）非小细胞肺癌细胞系缺少DMBT1的表达，而且与正常肺组织相比，45%（9/20）原发性非小细胞肺癌DMBT1的基因表达水平显著降低，且 10%（4/40）的小细胞肺癌细胞系存在DMBT1的纯合性缺失。并通过对8个非小细胞肺癌细胞系和20例原发性非小细胞DMBT1区编码测定，在非小细胞肺癌细胞系中测定到52密码子的点突变，从而导致编码的氨基酸由丝氨酸转变为色氨酸，认为DMBT1基因缺失或其他不明机制引起的DMBT1基因表达缺失在肺癌的发生中起了一个重要的作用。周爱莲等[16]用聚合酶链反应检测原发性肺癌DMBT1基因纯合性缺失，发现37例肺癌组织中9例有DMBT1基因纯合性缺失，而其自身癌旁正常肺组织均无DMBT1基因的纯合性缺失，DMBT1基因纯合性缺失率,非小细胞肺癌组高于小细胞肺癌组，低、未分化肺癌组高于中、高分化肺癌组，伴有淋巴和/或远处转移组高于不伴转移组，有吸烟史组高于无吸烟史组（ P
4．4 DMBT1基因在其他系统肿瘤中的表达 Bikker等[18]应用免疫组化的方法测定涎腺肿瘤中DMBT1蛋白-涎腺凝集素（Salivary agglutinin SAG）的表达，发现在涎腺癌旁组织中SAG的表达上调，而在涎腺肿瘤中,与其自身正常组织或癌旁组织相比，SAG表达下调。认为SAG可以作为一个潜在的涎腺肿瘤指示剂和（或）涎腺肿瘤抑制因子。
Mollenhauer 等[19]研究发现，与正常表皮组织相比DMBT1和galectin-3在上皮起源的皮肤肿瘤中的表达也是下调的，指出DMBT1/galectin-3的缺失表达在皮肤癌的发生上起一定的作用。但同时也发现在黑色素细胞中DMBT1/galectin-3无表达，在8例痣中有1例，11例黑色素瘤中有1例有诱导表达，认为在黑色素瘤中DMBT1和galectin-3不可能作为一个典型肿瘤抑制基因起作用。
Braidotti等[20]研究指出：在正常的和增生的乳腺组织中，DMBT1的表达是重新分配和上调的，而在乳腺癌DMBT1的表达是下调的。认为DMBT1在乳腺癌中具有潜在的作用。而且DMBT1的表达与MCM的伴随表达，说明DMBT1可能与细胞周期的调节有关。
5 小结
DMBT1基因是一种侯选的抑癌基因，它既可通过参与免疫防御功能，又可通过促进细胞的分化，发挥其抑癌作用。但目前国内外对DMBT1基因的表达水平和DMBT1突变/缺失在肿瘤形成过程的作用，有时会得出颇具争论的结论。且关于DMBT1在调节蛋白质与蛋白质、细胞与细胞、及细胞内外基质相互作用的可能作用，以及和不同肿瘤的联系，需要在体内外进行更多直接功能研究来阐明。对其作用机理的进一步揭示及其在体内外生物学效应的进一步探讨，将为临床预防、诊断、治疗肿瘤和判断预后提供一条新途径。
参考文献
［1］Mollenhauer J,Wiemann S,Scheurlen W,et al.DMBT1,a new member of the SRCR superfamily,on chromosome 10q25．3-26．1 is deleted in m alignant brain tumors.Nat Genet,1997,17(1):32-39.
［2］ Mollenhauer J,Muller H,Kollender G,et al.SRCR/SID region of DMBT1 defines a complex multi-allele system representing the major basis for its variability in cancer.Gene Chromosomes Cancer,2002,35(3):242-255.
［3］ Mollenhauer J,Holmskov U,WiemannS,et al.The genomic structure of the DMBT1 gene:evidence for a region with susceptibity to genomic instability.Oncogene,1999,18(46):6233-6240.
［4］ Mollenhauer J,Herbertz S,Helmke B,et al.Deleted in m alignant brain tumors 1 is a versatile mucia-like molecule likely to play a differental role in digestive tract cancer.Cancer Res,2001,61(24):8880-8886.
［5］ Mollenhauer J,Herbertz S,Holmskov U,et al.DMBT1 encodes a protein involved in the immune defense and in epithelial differentiation and is highly unstable in cancer.Cancer Res,2000,60(6):1704-1710.
［6］ Hikita C,Vijayakamar S,Takito J,et al.Induction of terminal differentiation in epithelial cells requires polymerization of hensin by galectin 3．J Cell Biol,2000,151(6):1235-1246.
［7］ Al-Awqati Q,Vijayakumar S,Takito J,et al.Phenotypic plasticity and terminal differentiation of the intercalated cell:the hensin pathway.Exp Nephrol,2000,8(2):66-71.
［8］ Takeshita H,Sato M,Shiwaku HO,et al.Expression of the DMBT1 gene is frequently suppressed in human lung cancer.Jpn J Cancer Res,1999,90(9):903-908.
［9］ Wu W,Kemp BL,Proctor ML,et al.Expression of DMBT1,a candidate tumor suppressor gene,is frequently lost in lung cancer.Cancer Res,1999,59(8):1846-1851.
［10］Somerville RP,Shoshan Y,Eng C,et al.Molecular analysis of two putative tumor suppressor genes,PTEN and DMBT,which have been implicated in glioblastoma multiforme disease progression.Oncogene,1998,17(13):1755-1757.
［11］ Lin H,Bondy ML,Langford LA,et al.Allelic deletion analyses of MMAC/PTEN and DMBT1,lociin gliomas:relationship to prognostic significance.Clin Cancer Res,1998,4(10):2447-2454.
［12］ Samson M,Leuraud P,Aguirre-Cruz L,et al.Analysis of loss of chromosome 10q,DMBT1homozygous deletions,and PTEN mutations in oligodendrogliomas.J Neurosurg,2002,97(6):1397-1401.
［13］ Mori M,Shiraishi T,Tanaka S,et al.Lack of DMBT1 expression in oesophageal,gastric and colon cancers.Br J Cancer,1999,79(2):211-213.
［14］ 王越英，唐槐静，邵康，等.DMBT1基因在上消化道癌组织中的表达及意义.中华实验外科杂志，2002，19（6）：514-515.
［15］Sasaki M,Huang SF,Chen MF,et al.Decrease of deleted in m alignant brain tumour-1 (DMBT-1) expression is a crucial late event in intrahepatic cholangiocarcinoma.Histopathology,2003,43(4):340-346.
［16］ 周爱莲，文海云，何建猷，等.DMBT1基因纯合性缺失中与原发性肺癌临床病理特征的关系.肿瘤防治研究，2003，30（3）：184-186.
［17］ Petersen S,Rudof J,Bockmuhl U,et al.Analysis of the DMBT1 gene in carcinomas of the respiratory tract.Int J Cancer,2000,88(1):71-76.
［18］ Bikker FJ,van der Wal JE,ligtenberg AJ,et al.Salivary agglutinin/DMBT1SAG expression is up regulated in the presence of salivary gland tumors.J Dent Res,2004,83(7):567-571.
【关键词】 中药； 多药耐药； 分子生物学
目前，化疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，而在化疗过程中易产生肿瘤的多药耐药，大大降低了其疗效。因此，如何解决多药耐药就成为了提高化疗疗效，改善患者生活质量的关键问题。多药耐药(multidrug resistance，MDR)是一个多基因参与的过程，涉及多种耐药相关蛋白［1］。不同肿瘤具有不同的耐药表型，可以是某种耐药基因表达，也可能是多种耐药基因同时表达的结果，而由于中药的多靶点作用，其可通过作用于多个耐药相关蛋白达到逆转多药耐药的作用。目前，中药抗多药耐药的作用研究已深入到分子水平。本文概述近年来中药在逆转多药耐药的分子水平的研究进展。
1 肿瘤多药耐药经典途径
P-gp蛋白介导的多药耐药是研究最多，机制最为明确的多药耐药产生途径，因此被称为多药耐药的经典途径。由MDR1基因编码的P-gp蛋白ATP依赖性的药物泵，其是通过水解ATP提供的能量，将进入细胞内的药物泵出细胞，使得细胞内药物浓度不断下降，最终使药物细胞毒作用减弱甚至丧失出现耐药［2］。中药下调P-gp蛋白的实验研究较多，下面就分体外与体内实验分别阐述。
1.1 体外实验研究解霞等［3］对川芎嗪(TMP)逆转多药耐药机制的研究显示MCF-7/ADM 细胞P-gp蛋白表达率为(90.60±0.41)％，而加入非细胞毒性剂量川芎嗪后，耐药细胞P-gp的表达率则降为(69.10±1.65)％（P
1.2 体内实验研究李贵海等［6］粉防己碱对获得性多药耐药小鼠S180肿瘤细胞相关蛋白的调控研究显示单纯应用DDP的模型组，其P-gp蛋白的表达为13.13±5.33，而粉防己碱无毒性高低剂量组其表达分别降为7.41±3.35和9.22±2.36，且其抑制率显著提高，揭示逆转耐药的机制可能与其降低P-gp蛋白的表达有关。
另据实验报道，中药三氧化二砷、ECCG、甲基莲心碱、补骨脂素等也可下调P-gp蛋白的表达而达到逆转多药耐药的作用［7～10］。
2 多药耐药的非经典途径
由MDR1基因编码的P-gp蛋白过度表达介导的药物外排是产生MDR的经典机制，除此外，MDR还与多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白（LRP）、谷胱甘肽S转移酶、拓扑异构酶、细胞凋亡等多种非经典机制密切相关。
2.1 MRP介导的多药耐药多药耐药蛋白1(MRP1)属于ATP结合的盒式(ATP-binding cassette，ABC)运输蛋白家族成员，它可以通过细胞膜转运多种抗肿瘤药，从而限制抗肿瘤药进入细胞［11］。
徐萌等［12］用汉防己甲素逆转肺癌耐药实验研究发现经汉防己甲素处理12，24，36 h后MRP蛋白表达量的表达分别为32.21±4.79，30.56±4.58，25.55±7.58，而对照组则分别为53.42±7.42，52.98±10.35，60.98±9.37，差异有非常显著性意义(P
另外，王利等［14］葛根素逆转人胃癌裸鼠原位移植瘤多药耐药性的体内实验研究显示5-FU联合葛根素组MRP蛋白阳性表达率为37.5%，显著低于对照组生理盐水组（82.5%）及单纯5-FU组（74%）（P
2.2 谷胱甘肽介导的多药耐药多药耐药的产生机制复杂多样，其中谷胱甘肽S-转移酶活性的增强是产生多药耐药的重要机制。肖希斌等［15］的研究显示K562/A02细胞GST-π的PCR扩增带亮度较强，而经甲基莲心碱(Nef)处理组PCR扩增带亮度明显减弱，提示Nef在mRNA水平上抑制GST-π基因的mRNA转录，蛋白质印迹检测结果亦显示，未经药物处理的K562/A02组的蛋白杂交带，明显强于K562/A02+Nef组，表明Nef能抑制GST-π蛋白的表达。
苗立云等［16］青蒿琥酯逆转K562/A02细胞耐药性机理的研究显示K562/A02细胞内GSH呈现高表达(P
2.3 核转录因子介导的多药耐药核转录因子（NF-κB）在细胞增殖和凋亡中起关键调控作用，而目前有研究显示其在多药耐药的产生中也扮演着重要的角色，陈进伟等［17］K562/A02耐药细胞NF-κB活性测定的研究发现活化后K562/A02细胞NF-κB表达明显增强(P
2.4 LRP及拓扑异构酶介导的多药耐药肺耐药相关蛋白（LRP）与拓扑异构酶亦是近期研究较多的耐药介导介质。LRP作用机制是通过降低药物的核质分布比率和通过囊泡、胞吐作用将药物排出细胞［19］。拓扑异构酶(TopoⅡ)是调控DNA拓扑状态的酶类，据研究发现，TopoⅡ质和量的改变会直接影响与DNA的结合，导致药物诱导产生的裂解复合物形成减少，从而导致耐药。孙付军等［20］研究发现苦参碱可以逆转小鼠S180肿瘤细胞获得性多药耐药，其研究表明经其诱导后LRP、TOPOⅡ小鼠瘤体中可呈稳定高表达，而给予小鼠100mg/kg苦参碱后的瘤体中两种蛋白的表达率分别降低为（10.76±6.28）%和（8.58±4.1）%，与对照组相比呈现显著性（P
2.5 降低细胞内CA2+浓度Ca2+是细胞内一个重要的调节细胞生长、分泌和传导等机制的信使，自从Tsuruo等初次发现MDR表型的肿瘤细胞内游离Ca2+浓度增高以来，许多实验证明耐药肿瘤细胞中Ca2+浓度高于非耐药肿瘤细胞，又有学者证实钙拮抗剂可逆转细胞对药物的耐药性。蔡宇等［23］补骨脂素对HL60/HT耐药细胞逆转及对细胞内Ca2+浓度影响研究发现耐药株HL60/HT细胞内Ca2+浓度明显高于敏感株HL60(P
2.6 凋亡相关基因介导的多药耐药Bcl-2家族是细胞凋亡的关键调控物，其中Bcl-2相对分子量为26 000，蛋白水平与肿瘤细胞的MDR相一致，其过表达的肿瘤细胞凋亡受抑制，同时对阿霉素、长春新碱、顺铂等多种化疗药物耐药，其机制可能在于其产物可以稳定细胞生存，抑制多种因素，包括化疗药物诱导的细胞凋亡，从而使细胞产生耐药［25，26］。
艾小红等［27］甲基莲心碱逆转肝癌HepG2/thermotolerance细胞对阿霉素耐受性的作用发现HepG2/thermotolerance细胞较HepG2细胞高表达Bcl-2蛋白，而甲基莲心碱能够下调HepG2/thermotolerance细胞的Bcl-2表达。钟陆行等［28］参芪扶正注射液对K562/ADM多药耐药的影响研究显示K562/ADM 细胞Bcl-2基因呈现高表达，经10 μl/ml参芪处理后其表达为68.39±3.89，而正常对照组则高达(93.82±2.32)，由此可见参芪扶正注射液可以明显下调Bcl-2表达率。
3 多靶点作用逆转机制
整体观念是中医的基本特点之一。从现代研究的角度看，可以体现在中药治疗肿瘤的多靶点作用。在逆转多药耐药中，中药的作用机制也并非只局限于某一点，而是一个综合的作用，这也正是中药在逆转多药耐药研究中越来越受到人们重视的原因之一。
3.1 体外实验研究侯华新等［29］用板蓝根高级不饱和脂肪酸对耐药肝癌细胞株BEL-7404/ADM逆转作用实验发现P-gp、MRP蛋白在Bel-7404/ADM 细胞中呈现高表达（与Bel-7404相比，P
3.2 体内实验研究董琳等［32］甲基莲心碱对胃癌多药耐药的逆转作用研究发现P-gp、MRP在 SGC7901/VCR细胞中呈现高表达（P
4 结论与展望
目前，研究发现多药耐药的产生主要存在以下几个方面的机制：①P-gp蛋白介导的耐药，另多药耐药相关蛋白(MRP)及肺耐药相关蛋白(LRP)的异常表达也受到重视；②酶系统异常，包括GSH，GST，DNA拓扑异构酶(TOPOⅡ)和PKC活性改变；③bc1-2基因高表达是抑制肿瘤细胞凋亡、导致肿瘤耐药的重要因素。而综合国内文献发现，中药对多药耐药的逆转作用亦是多渠道、多途径的，往往也是通过对不同耐药途径的综合调控作用而实现的。
不过，我们通过对近几年的文献研究可以发现中药在逆转多药耐药研究中亦存在一定的问题，其主要体现在以下几个方面：①研究多偏重于单体，而对复方研究较少，难以体现中医辨证施治的特点；②对机制的研究多偏重于经典途径，而对非经典途径研究相对较少；③中药对多药耐药的逆转作用往往是多方面的，而有些文献报道多只对单个耐药相关蛋白表达进行研究，不免存在以偏概全之嫌；④亟需探索中药研究的新方法，从而来弥补中药成分复杂给实验带来不稳定性。
总之，通过对近5年的相关文献分析，我们发现中药在逆转多药耐药的研究中已深入到分子生物学水平。其逆转作用往往是通过对不同的耐药蛋白的综合作用而实现的。由于中药成分的不单一性，使其作用往往不局限于某单一靶点，而是体现于多个靶点。其是通过多靶点的综合作用，从而可以从多角度、多层次来发挥逆转多药耐药的作用，另外中药体现出了毒副作用小，作用显著的优点而愈加受到国内外学者的关注。中药逆转剂的进一步研究推广势必有益于化疗疗效的提高和晚期癌症患者的生活质量的改善。
【参考文献】
［1］ Borowski E，Bontemps-Gracz MM，Piwkowska A．Strategies for overcoming ABC-transporters-mediated multidrug resistance(MDR) of tumor cells［J］．Acta Biochim Pol，2005，52f3):609．
［2］ Ambudkar SV，Dey S，Hrycyna CA，Ramachandra M，Pastan I，Gottesman MM.Biochemical，cellular，and pharmacological aspects of the multidrug transporter［J］.Annu Rev Pharmacol Tbxicol，1999，39:361.
［3］ 解 霞，郝立宏，高清波，等.川芎嗪逆转肿瘤多药耐药性及其机制的研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2009，12(18):1368.
［4］ 谢长生，周维顺，冯正权，等.复方三根制剂对MDR细胞株K562/ADR和K562/VCR逆转作用的研究［J］.中国实验方剂学杂志，2003，9(4):26.
［5］ 许文林，江云伟，王法春，等.汉防己甲素逆转K562/ADM细胞株多药耐药性机制研究［J］.实用癌症杂志，2003，18(4):347.
［6］ 李贵海，刘明霞，孙付军，等.粉防己碱对获得性多药耐药小鼠S180肿瘤细胞P170，LRP，TOPOⅡ表达的调控［J］.中国中药杂志，2005，30(16):1280.
［7］ 赵园园，金 锋，梁 军，等.三氧化二砷对人胃癌耐药细胞系SGC7901/ADM耐药逆转及凋亡诱导作用的探讨［J］.中国肿瘤临床，2005，32(11):611.
［8］ 林晓贞，梁 钢，黎 莉，等.ECCG对两株耐药肿瘤细胞的细胞毒增敏作用及抑瘤作用研究［J］.中药药理与临床，2006，22(1):30.
［9］ 黄程辉，曹培国.甲基莲心碱对乳腺癌MCF-7/Adr细胞MDR逆转的研究［J］.肿瘤防治研究，2007，34(5):351-354.
［10］ 蔡 宇，蔡天革.补骨脂素逆转多药耐药细胞系K562/ADR耐药性研究［J］.中国药理学通报，2003，19(10):1164.
［11］ DeGorter MK，Conseil G，Deeley RG，et al.Molecular modeling of the human multidrug resistance protein 1 (MRP1/ABCC1).Biochem Biophys Res Commun，2007，365(1):29.
［12］ 徐 萌，周 蓓.汉防己甲素逆转肺癌化疗耐药和凋亡的实验研究［J］.新中医，2006，38(6):90.
［13］ 成 静，冯觉平，王亚平，等.三氧化二砷对人肺腺癌A549/R细胞多药耐药相关蛋白表达的影响［J］.医药导报，2007，26(5):457.
［14］ 王 利，魏品康，秦志丰，等. 葛根素注射液逆转人胃癌裸鼠原位移植瘤多药耐药性的实验研究［J］.成都中医药大学学报，2005，28(1):42.
［15］ 肖希斌，谢兆霞，秦 群.甲基莲心碱抑制K562/A02细胞GST-π的表达［J］.西安交通大学学报，2005，26(5):428.
［16］ 苗立云，张祖贻. 青蒿琥酯逆转K562/A02细胞对阿霉素耐药性机理的研究［J］.东南大学学报，2006，25(6):445.
［17］ 陈进伟，骆 蓉，张广森，等. K562/A02耐药细胞NF-κB活性测定及葛根素部分逆转耐药效应的初步研究［J］.中华血液学杂志，2006，27(7):482.
［18］ 宋玉成，夏 薇，江金花，等.盐酸千金藤素逆转EAC/ADR细胞多药耐药性的作用及其机制［J］.药学学报，2005，40(3):204.
［19］ Kawabata S，Oka M，Shiozawa K，et al.Breast cancer resistance protein directly confers SN-38 resistance of lung cancer cells. Biochem Biophys Res Commun，2001，280：1216.
［20］ 孙付军，王 宁，李贵海，等.苦参碱对获得性多药耐药小鼠S180肿瘤细胞表达产物P170、LRP及TOPOⅡ表达的影响［J］.中药材， 2004，27(11):838.
［21］ 季旭明，欧阳兵，王春燕，等.温下方逆转A549/DDP细胞的多药耐药及对膜表面蛋白表达的影响［J］.中国药物与临床，2006，6(12):885.
［22］ 盖晓东，曾常茜，洪 敏.柴胡逆转肝细胞癌多药耐药作用与相关机制的研究［J］.高等学校化学学报，2005，26(8):1446.
［23］ 蔡 宇，余绍蕾，徐 炎，等.补骨脂素对HL60/HT耐药细胞逆转及对细胞内Ca2+浓度影响研究［J］.中国药学杂志，2006，41(12):905.
［24］ 王金华，叶祖光，孙爱续，等.粉防己碱逆转人乳腺癌MCF-7多药耐药细胞的抗凋亡作用［J］.中国中药杂志，2002，27(1):46.
［25］ Gadducci A，Cosio S，Muraca S，et al.Molecular mechanisms of apoptosis and Chemosensitivity to platinum and paclitaxel in ovarian cancer: biological data and clinical implications［J］. Eur J Gynaecol Oncol，2002，23(5):390.
［26］ Gadducci A，Cosio Pommier Y，Sordet O，et a1.Apoptosis defects and chemotherapy resistance:molecular interac tion maps and networks［J］. Oncogene，2004，23(16):2934.
［27］ 艾小红，唐小卿，刘艳萍，等.甲基莲心碱逆转肝癌HepG2/thermotolerance细胞对阿霉素耐受性的作用［J］.癌症，2007，26(4):357.
［28］ 钟陆行，熊建萍，张锡泉，等.参芪扶正注射液对K562/ADM 多药耐药的影响［J］.江西医学院学报，2006，46(4):41.
［29］ 侯华新，黎丹戎，韦长元，等.板蓝根高级不饱和脂肪酸对耐药肝癌细胞株BEL-7404/ADM逆转作用实验［J］.中国现代应用药学杂志，2002，19(5):351.
［30］ 王 利，魏品康，秦志丰，等.榄香烯对耐药胃癌细胞的逆转实验研究［J］.成都中医药大学学报，2005，28(2):51.
［31］ 盖晓东，曾常茜，洪 敏.柴胡逆转肝细胞癌多药耐药作用与相关机制的研究［J］.高等学校化学学报，2005，26(8):1446.
［32］ 董 琳，唐小卿，曹建国，等.甲基莲心碱对耐长春新碱人胃癌细胞多药耐药性的逆转［J］.中国病理生理杂志，2004，20(8):1407.
[关键词]医学分子生物；实验教学；教学改革；医学检验
21世纪是生命科学的世纪，生命科学的发展伴随着探究技术的提升和人才的培养。在科学发展过程中，分子生物学的理论和技术已与生物学，医学和药学等众多领域交叉、融合，是提高探究技术水平和人才质量的一门重要学科[1]，因此，作为医学人才培养的医学院校，医学分子生物学是不可缺少的一门学科。目前，我校仅对医学检验专业和医学实验技术专业开设医学分子生物学的理论和实验教学。本文总结了一些在医学分子生物学实验课教学过程中的心得和体会，希望通过不断的反思和改进培养出满足社会和人民需要的高素质人才。
1医学分子生物学实验课的主要特点
医学分子生物学是一门理论与实践相结合的医学基础学科，以核酸和蛋白质为研究对象，利用先进的分子生物学实验技术对临床疾病进行诊断，特别是进入21世纪后的短短几年，无论是疾病发生、发展机制的阐明，患病风险的预测与评价，还是疾病的早期诊断和个体化医疗的开展，都愈来愈依靠和依赖分子生物学[2]，常见检测内容包括微生物检验[3]、肿瘤诊断[4-5]、遗传病诊断[6-8]和人体各类免疫疾病[9]等。
临床中应用医学分子生物学技术的項目很多，但目前学院针对医学生开设的分子生物学实验项目有限，例如小鼠肝组织DNA提取和保存，琼脂糖凝胶电泳检测核酸，PCR技术等。然而，医学分子生物学技术发展迅速，传统的医学分子生物学实验室仅结合学院现有的条件开展分子生物学实验教学项目，内容陈旧，技术简单，缺乏临床结合，不利于学生动手能力和创新能力的培养。随着分子生物学的不断发展，越来越多的高等学校将分子生物学设为必修课和选修课。我们作为国家医学人才培养的摇篮，随着技术的更新和发展，国家和社会对医学分子生物学重视程度的增加，这对老师和学生提出了更高的要求，教师应不断更新教学内容和实验技术，学生应掌握理论知识和实验技术，设计实验紧密结合临床，紧跟科学技术发展的步伐。
2目前医学分子生物学实验教学面临的问题
2.1分子生物学实验室建设不足
医学分子生物学是21世纪研究的新兴学科，主要以核酸和蛋白质分子为研究对象，对实验室的条件和设备的投入要求较高，然而目前学院对分子实验室建设的重视程度不高，通常与其他学科共用实验室，实验环境达不到标准，仪器共用、陈旧且破损，使得分子实验不能顺利开展；分子实验的目的是通过将理论知识应用于实践进而培养学生的动手能力、结果分析能力和创新能力，但分子实验试剂和耗材均需进口，价钱昂贵，在实验试剂和耗材使用方面不能满足人人均有，导致大部分学生没有参与实验，降低了学生对分子生物学实验课的积极性。分子生物实验均需要低温高速离心，为了提高分子实验结果的成功率，低温高速离心机是分子生物学实验室必备的，且每个教室最少配备一台低温高速离心机。在核酸电泳检测过程中，需要使用溴化乙锭（EB）或其替代物染色，而溴化乙锭为强致癌物质，因此，实验室需要设置EB专用实验台，避免学生操作不当引起实验隐患；对于核酸电泳结果均要在紫外灯下检测，紫外灯下不利于实验结果的分析，也不能确保所有学生都能观察到实验结果，准确分析实验结果，学院应在学生教室配备多媒体，将每个实验结果直观地展现给学生，让学生观察并分析，带动学生的积极性，因此，为了培养社会和国家需要的创兴型人才，学院应该加强分子实验室的建设，建立单独的分子生物学实验室，对相应仪器和耗材的采购应给予大力支持。
2.2实验用品准备不规范
分子生物学实验对试剂和耗材洁净度高，且试剂名均为英文，分子生物学这门课程的理论和实验内容在学院的开设时间较晚，现在从事分子实验耗材准备的老师专业和英语水平有限，在实验试剂、耗材和仪器准备过程中空难重重，且准备不全面，影响实验的顺利开展。为了促进分子生物学实验顺利进行，降低实验准备中试剂和耗材的损失，实验室或代课教研室应对实验技术老师进行规范性培训，如RNA提取过程中使用的吸头和离心管均为无RNase，学生实验开始前应组织实验老师了解实验条件的严格性，在口罩和手套配备齐全的基础上，将吸头放置配套的吸头盒内，而不是随意将吸头倒在一次性手套上，这将误导学生对分子生物学实验严谨性的认识。学院也可以相应的引进分子生物学背景的实验技术老师从事教辅或教学工作，这对于分子生物学实验顺利而准确的进行起到重要作用。
3医学分子生物学实验课教学心得
3.1完善分子生物学实验内容和指导手册
分子生物学是跨越生物、医学、农学乃至药学的一门新型学科，优质的分子生物学实验课程开设离不开与相关专业的紧密渗透[10]。目前我院仅对医学检验专业和医学实验技术专业开设分子生物学实验，这就要求教师结合学生的专业和发展方向设计实验内容。只有结合学生的专业才能更好的将理论和实际相结合，激发学生的积极性。在目前教学中，只能依据实验室的环境和设备的变化，结合教学老师主持的科研课题开展一些简单的分子生物学实验，而忽略了结合学生的专业开设特色的实验内容。由于固定的实验材料和内容多变，没有完善的分子生物学实验指导手册，这使学生对即将做的实验毫无头绪，降低了学生学习分子生物学的积极性，不利于学科的发展和创新人才的培养。
3.2建设师资队伍
分子生物学实验内容设计，实验方法的使用以及实验结果的解析与教学老师的知识背景和能力具有紧密的联系，也是确保良好教学质量的关键。目前我们生物与分子生物学教研室的老师分别承担国家自然科学基金，省级科学基金、省级教育厅课题以及校级课题等多项科研项目，且均为硕士研究生以上学历，具有较扎实的分子生物学理论基础和熟练的分子生物学技术，可以巧妙灵活的为学生设计相关的分子实验内容。但是分子生物学内容和技术更新换代，学院可以提倡或执行“送出去，引进来”的政策，让教师得到全面的提高，让学生拓宽眼界享受先进的知识课堂。
3.3提高学生的重视度
分子生物学是一门抽象难懂的技术学科，学生对分子生物学的理论和技术应用了解的并不多，所以学生对分子生物学理论学习和实验操作均表现为消极，应付的心态。导致学生对分子生物学不重视态度的原因之一，是学生没有了解到分子生物学在临床或是研究生生活中的重要性。目前，我们教授的学生为大三学生，已经有了很强的思考能力，对自己的发展有了一定的规划，为了提高学生对分子生物学的重视程度，学院可以安排学生进入实习单位，比如医院，检测单位或是一些科研机构，让学生在实实在在的生活中了解分子生物学的中重要性以及操作过程的规范性；也可以举办学生经验交流会，让学院已经毕业工作的学生、实习的学生或者读研究生继续深造的学生分享分子生物学的重要性，提高学生的自主学习能力和对分子生物学由衷地热爱。
3.4增加多媒体教学
多媒体课堂教学已成为理论课上必不可少的教学手段，但在实验教学中应用的较少。分子生物学是通过多种先进技术手段研究核酸等生物大分子的功能、形态结构及其重要性和规律性的科学[11]。其内容抽象，枯燥无味，实验结果无法直观地展现给学生，使学生很容易产生厌学的情绪[12]。为了提高教学质量，我们应该利用多媒体将一些难懂的分子生物学技术原理和过程通过动画、幻灯片和视频等直观地展现给学生，如大肠埃希菌质粒的提取和检测，PCR技术的原理和操作过程等，使学生在轻松愉快的氛围下，快速掌握分子生物学知识。实验结果检测过程中，我们可以通过多媒体将检测的结果展示给学生，让学生观察讨论，给出依据并提出相应的答案，教师通过分析学生的討论结果，了解学生的思维动态，并给出正确结果。根据学生的反馈，板书教学结合多媒体展示利于学生对知识的认知和掌握。
3.5开放实验室
要想成为一名国家需要的优秀人才，除了掌握扎实的理论知识，具有熟练的实验室操作技能，同时也要具备活跃的创新思维。因此，为了更好地培养学生的各方面能力，实验室可以结合实际课程开放实验室，让学生查阅文献，巩固理论知识，应用实验课上的分子生物学技术结合临床疾病设计实验，给学生提供更多的动手机会，培养学生的自主学习能力和创新能力[13-15]，同时提高学生对分子生物学课程的兴趣和重视。在开放实验室期间，至少安排一位指导教师，既规范学生的操作技能，又可以帮助学生分析实验结果，这样培养学生的思考能力和分析问题的能力。目前学校仅对医学检验专业和医学实验技术开设医学分子生物学实验课，开放分子生物实验室，不仅让已学习分子生物学的专业的学生巩固理论知识和实验课内容，也为其他医学生提供了学习机会和创新平台。
3.6鼓励学生参与教师科研
生命科学的研究离不开分子生物学技术，目前学校的教师均有自己的研究课题，学生可以适当参与教师的科研工作，了解分子生物学的重要性，增强学生学习的主动性和积极性。学校也为学生开设大学生创新项目，学生将学习的分子生物学理论和实验技术结合临床设计实验，大大地发挥学生的主观能动性，激发学生的求知欲和创新能力。科研和教学的相互结合，相互渗透，不仅丰富了分子生物学实验教学的内容，也提高了学生的综合素质和科研思维[16]，为国家和社会培养更优秀的人才。
3.7改革实验成绩评定方法
常规的实验成绩评定是根据学生提交纸质的实验报告进行评定，然而，医学分子生物学实验课不仅仅评定学生掌握的理论知识，同时考察学生们的动手能力、分析结果能力、创新能力等，因此，将医学分子生物学实验成绩评定内容分为实验理论测评和实验操作技能测评，实验理论测评包括实验原理，实验步骤以及实验内容的应用，这样有利于学生自主学习医学分子生物学并加深对分生生物学的认识；实验操作技能的测评：考察学生的实验设计能力、动手操作能力、实验结果分析能力。经过观察实验课堂学生的表现，部分同学主动参与到实验课堂中，而其他同学仅仅是旁观者，通过实验成绩评定的改革，提高学生实验设计能力、自主动手能力和分析问题能力，为国家和社会培养创新人才具有重要的意义。
4总结
根据我国农业畜牧业的现有基础以及对动物生物技术的实际需求，国家应该集中各种力量，着重对生物技术开展基础性的研究，加大技术的投资力度，对一些利润高的技术产品进行重点投资，根据我国农业动物生物技术的现有基础和社会发展变化的主要形势，预计农业生物技术将在以下几个领域取得长足发展。
1.分子生物学技术
由于农业养殖日益呈现出规模化与集约化较高的特征，再加上人们对短期经济效益的集中追求，所以我国传统的畜禽品种资源将会遭遇越来越严重的破坏，其群体数量将日益降低，品种资源的破坏形势会日益加深，根据这种现实情况，未来农业动物生物技术将在以下分子生物领域进行发展：对我国固定的优良品种或基因进行挖掘与定位；为畜禽的遗传多样性进行保护的分子监测技术；我国固有畜禽品种的起源与进化的比较基因组学研究；保存动物遗传资源的生物技术研究。
2.分子育种技术
我国农业中的畜禽育种工作经过长时间的发展，逐渐由追求数量转向追求质量，育种方法也逐渐由数量遗传法转向分子育种与常规育种相结合的方法，所以分子育种技术的改进将是未来阶段我国农业动物生物技术的一个主攻方向，分子育种技术的研究将集中在标记辅助育种技术、数量性状主基因的检测和定位技术、动物功能和抗病基因的诊断技术以及试剂盒的研究，通过这些方面的技术研究提高动物产品的质量，实现其最大效益。
3.分子诊断技术
畜禽疫病是对我国畜牧业生产以及产品安全造成主要影响的关键因素，畜禽疾病的危害严重、流行面广，潜在危险性较大，一旦发生就会造成较大的经济损失，因此，利用免疫学、现代分子生物学以及病毒学的相关技术，对我国畜禽的重要疫病进行分子生物学研究是是农业动物生物技术的主要发展趋势之一，主要包括：重要畜禽疫病的分子诊断、监测、重要畜禽疫病病原的大分子结构与功能研究以及试剂盒的研发。
4.转基因动物技术转基因动物是一种将胚胎工程与分子生物学有机结合而研究出来的一种基因工程动物，这种技术是克隆技术的突破性进展，影响动物发育过程中的基因表达，能够促进遗传学与发育生物学以及相关学科的发展，是加快动物育种进程、提高育种效率，为濒危动物提供生存方式的有效方法。
二、结语
电子商务物流管理课程教学发展现状
虽然教育部门在各个高校开设了电子商务物流管理课程，但是从发展实际上看，当前的高校电子商务物流管理发展水平高低不一，总体表现为，沿海经济发展快速的地区电子商务物流管理课程开展水平和开展效果良好，与之相对的西部地区则是发展较为落后。在电子商务物流管理教学发展中，人们加强了对实践教学和信息技术软件的应用，调动各种力量对教学环境进行了改变，投入了大量的资金来加强物流实验教师的建设，为学生的电子商务物流学习提供了设施的支持。但是，电子商务物流管理的实际训练发展仍停留在应用简单的物流模拟操作软件来完成训练，所应用的设施和实际教学需要不相匹配，因而没有达到预期的人才培养目标，即高校电子商务物流管理的教学模式安排及发展实际和社会对电子商务物流管理人才的需求不适应。
电子商务物流教学管理和社会对电子商务管理人才需求不相适应的原因
有关领导在思想上不重视
现阶段电子商务物流教学开设的课程众多，但是课程的开设不具有针对性和实际应用性，导致学生在学习完之后不能将所学的知识充分应用到实践中。比如《电子商务物流管理》课程是电子商务物流教学的核心课程，理论性很强，但也需要能够被应用到实践中。因此，在教学中要求将实践和理论充分结合，但是实际教学由于学校领导的重视和认识不够，使得课程开展的实际意义不大，在理论学习枯燥的情况下，学生失去了学习的兴趣。
教学设备应用不完善
电子商务专业教学中开设了与之相关的物流管理课程，但是这门课程的实践性不够，在具体的实践设备安排上甚至还不如职业技术类学校的要求，在设备不完善的情况下相关的电子商务物流管理课程很难有效开展。
教学目标不明确
很多高职院校将电子商务物流管理课程作为重要的基础性课程，在教学管理中予以重视，但是实际教学和教学目标之间存在巨大的落差，对于电子商务物流管理专业学生所必备的专业知识和技能培训不够，难以保证学生能够胜任未来的工作。
教学内容设计不规范
电子商务物流管理课程目标设置的不明确由此导致电子商务物流教学中经常更换教师，对教学内容 侧重点的设置带来了麻烦，出现了内容五花八门的现象，教师在教学内容的设计上会根据自己的喜好进行，忽视了学生的学习需要以及对知识的接受能力，且教学内容侧重点会跟着教师的变化发生变化，学生在对知识的学习方面缺乏统一的规范。
校企合作缺乏必要的渠道
电子商务物流管理是一门融合了理论和实践的课程，因此在学生掌握了必要的知识技能之后需要对其进行实践的引导。但是现阶段的电子商务物流教学模式中忽视了对实践的重视，导致教学和实践的脱离，不利于学生的学习和教学目标的实现。
电子商务物流管理教学模式的创新构建
加强对电子商务物流管理教学目标的明确
学校在对电子商务物流管理专业人才培养的时候，要设定好明确的人才培养发展目标，在目标的设置上要充分考虑电子商务物流管理教学和与之相关的社会岗位需求之前的关系。教学目标的设置不能脱离实际的发展需要，并要以电子商务物流企业对人才的实际需求为教育教学的根本出发点和落脚点，采用合理有效的措施来对人才进行培养。
对电子商务物流管理的教学内容进行调整
在社会的不断发展下，人们对电子商务企业的发展加深了重视，同时，在物流业的渗透发展下，有关人员深刻认识到了电子商务物流管理的对促进电子商务发展的重要意义。高校也开设了相关的课程，并对课程教学内容设计提出了新的要求，即电子商务物流管理教学内容的设置要加强对物流学信息化、物流供应链发展管理、物流仓储配送的重视，在教学内容中加强这些课程的比例，并要在教学内容中融入电子信息技术知识，从而促进电子商务物流管理的创新化、科技化发展。
选择和教学目标相符合的具有针对性的电子商务物流管理教材
电子商务物流管理教学注重理论和实际的结合，因而在教材选择上也要注重理论和实践的结合，教材内容要尽可能多地涉及到物流的采购、仓储、运输、配送以及装卸搬运等知识，并要求教材的选择要具有指导实践的针对性意义。
加强校企合作交流，构建一种校企合作的实践型课程体系
电子商务物流管理人才需要具备物流管理知识技能以及计算机应用技能，即电子商务物流管理人才是一种精通管理和技术的高素质复合型人才。为了培养出这样的人才，有关教育人员需要在研究电子商务物流管理企业发展需要的基础上，通过设计一些具有实践性质的课程来提升学生的实际演练能力，帮助学生将自己所学的知识转化为实践应用技能，充分做到用理论指导实践，使得自己的能力发展和企业对自己的需求相适应。
加强对国外物流管理课程教学管理经验的借鉴
