关键词：地福来生物细胞肥；示范；增产效果分析
中图分类号 S14 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）24-71-02
生物肥料是作物用肥的发展方向。根据产品介绍，“地福来”活性细胞肥，利用生物固氮，能为农作物的整个生长周期提供所需的30%～50%的氮肥，即节约30%～50%的氮肥用量，作物施用这种“细胞肥”后，不仅能增加作物产量、缩短生长周期、提高品质、减少化肥使用量、改良土壤，而且能够增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。所以，2013年笔者在枞阳县布置了3个水稻示范点。具体如下：
1 枞阳县浮山示范点示范情况
1.1 示范目的 本次示范目的是在同等的施肥管理水平下，增加水稻产量。
1.2 示范地点 枞阳县浮山乡。
1.3 示范方法 对比法。
1.4 示范情况 栽培方式：育苗移栽；品种：优Ⅰ402；用种量：2kg/667m2；4月5日播种，5月4日移栽，5月13日除草。分别于4月28日防治灰飞虱、稻蓟马；5月21日防治稻蓟马；6月20日防治稻苞虫，纹枯病。
表1 浮山地福来生物细胞肥水稻施用示范基本情况
[示范品种＼&栽培方式＼&施用时间
（月/日）＼&用肥量
（mL/667m2）＼&施肥方式＼&优Ⅰ402＼&秧田＼&4/18＼&200＼&喷雾＼&优Ⅰ402＼&育苗移栽＼&5/24＼&200＼&喷雾＼&]
6月24日，示范田早稻正处抽孕穗期，平均茎蘖15.6个，对照平均茎蘖13.6个。预计抽穗比对照早7d左右。
1.5 7月22日，对浮山示范点进行测产，结果如表2：
从表2可以看出，主要表现地福来大田专用肥示范田比对照田有效穗数多3.16万/667m2，由于分蘖穗多，示范田平均穗粒数、结实率比对照田略低，经计算产量结果得出，浮山点地福来大田专用肥示范田比对照田增产57.51kg/667m2。
表2 浮山示范点理论产量构成与产量
[处理＼&穗数（万/667m2）＼&每穗粒数＼&结实率（%）＼&千粒重
（g）＼&理论产量
（kg/667m2）＼&实际产量
（kg/667m2）＼&总粒数＼&实粒数＼&专用肥＼&17.35＼&117.86＼&106.81＼&90.6＼&25＼&463.29＼&393.8＼&对照＼&14.19＼&118.06＼&111.5＼&94.4＼&25＼&395.64＼&336.29＼&]
2 陈瑶湖示范点示范情况
2.1 示范目的 本次示范目的是在同等管理水平，施用地福来大田专用肥的示范田比对照田每667m2减少5kg氮、磷、钾含量18%的复合肥的条件下，分析增产效果。
2.2 示范地点 枞阳县陈瑶湖乡
2.3 示范方法 同一田块，共0.533hm2，一分为二，示范田、对照田各0.266hm2。进水口为对照田，出水口为示范田。
2.4 示范情况 栽培方式为点播；品种早稻嘉兴8号；用种量7.5kg/667m2；4月18日撒播。
除草时间：4月25日用36%直播净45～60g/667m2兑水45～60kg均匀细致喷雾。药后7d内保持畦面湿润状态。
5月21日，秧龄33d进行秧苗素质考察，地福来大田专用肥示范田秧苗比对照株高高8.3cm，平均分蘖数多0.4个，绿叶数、白根数等都有优势。具体情况如表4。
表3 陈瑶湖地福来生物细胞肥水稻施用示范基本情况
[处理＼& 施肥一 ＼& 施肥二 ＼& 施肥三 ＼&种类＼&数量
（mL/667m2）＼&施肥时间＼&种类＼&数量
（kg/667m2）＼&施肥时间＼&种类＼&数量
（kg/667m2）＼&施肥时间＼&地福来示范田＼&地福来专用肥＼&200＼&5月2日＼&46%尿素＼&15＼&5月16日＼&48%复合肥＼&20＼&5月21日＼&对照田＼&空白＼&0＼&5月2日＼&46%尿素＼&15＼&5月16日＼&48%复合肥＼&25＼&5月21日＼&]
表4 5月21日秧苗素质考察记载
[处理＼&绿叶数
（片）＼&株高
（cm）＼&根数（个）＼&分蘖数
（个）＼&总根数
（个）＼&白根数
（个）＼&白根率
（%）＼&地福来
专用肥＼&4～4.5＼&30.61＼&22.1＼&10.4＼&47.06＼&1.5＼&对照＼&4～5＼&22.31＼&17.7＼&6.8＼&38.42＼&1.1＼&]
2.5 产量结果分析 7月14日，对陈瑶湖周真信早稻示范田进行测产，从表5可以看出，地福来大田专用肥示范田比对照田667m2有效穗数多3.34万穗，平均穗粒数、结实率比对照略低，经计算得出，地福来大田专用肥陈瑶湖示范田比对照田增产31.47kg/667m2。
表5 陈瑶湖点理论产量构成与实际产量
[处理＼&667m2
穗数（万）＼&每穗粒数＼&结实率（%）＼&千粒重
（g）＼&理论产量
（kg/667m2）＼&实际产量
（kg/667m2）＼&总粒数＼&实粒数＼&地福来
专用肥＼&22.67＼&93.72＼&84.97＼&90.65＼&25＼&481.52＼&409.29＼&对照＼&19.33＼&102.5＼&91.96＼&89.72＼&25＼&444.50＼&377.82＼&]
3 项铺镇唐山圩示范点情况
3.1 示范目的 本次示范目的是在同等的施肥管理水平下，以增加产量为目的。
3.2 示范地点 项铺镇唐山圩周学斌示范田
3.3 示范方法 同一田块，共计0.667hm2，示范田0.333hm2、对照田0.333hm2。进水口为对照田，出水口为示范田。
3.4 示范情况记载 栽培方式为机插秧；品种为单季糯稻品种：太湖糯。6月24日机插秧，秧龄20d。6月25日开始下大雨，秧苗水淹3d以上，7月9日秧苗补棵结束。9月5日进入孕穗期。9月9日田间观察，分蘖数无差别。
施肥情况：（第一次）6月中旬，施基肥17%复合肥20kg/667m2。机插秧苗后7d即7月4日追施尿素7.5kg/667m2。退水后（第二次）追施12.5kg/667m2尿素。返青后（第三次）追施10kg/667m2尿素，18%复合肥15kg/667m2。7月30日，示范田施用地福来大田专用肥200mL/667m2（1瓶），对照田未施用。9月4日，追施（穗肥）BB肥12.5kg/667m2。整个生育期共施用3次叶面肥（7月22日、8月10日、9月30日）。
3.5 产量结果分析 10月6日，对唐山圩示范田进行测产，结果如表6。当时示范田内水稻正值灌浆期，所以只测667m2有效穗和每穗总粒数。结实率统一按90%计算。从苗情长势分析，预计示范田比对照田成熟期早5～6d。
表6 唐山圩点理论产量构成与实际产量
[处理＼&穗数（万/667m2）＼&每穗粒数＼&结实率（%）＼&千粒重
（g）＼&理论
产量
（kg/667m2）＼&实际
产量
（kg/667m2）＼&总粒数＼&实粒数＼&地福来
专用肥＼&19.93＼&115.7＼&104＼&90＼&27＼&542.62＼&462.2＼&对照＼&19.83＼&94.71＼&85.24＼&90＼&27＼&456.38＼&387.9＼&]
4 结论
目的初步探讨何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响。方法MTT比色法检测何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞生长的促进作用；HE染色法观察其流分对人脐静脉血管内皮细胞形态学的影响。结果经聚酰胺柱层析洗脱的何首乌流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖具有不同的作用，其中D流分随着浓度的增加，对人脐静脉血管内皮细胞增殖具有促进作用，显微镜下观察到细胞的数量及分裂相增多，B和C流分对细胞的增殖影响不大，而A流分对血管内皮细胞具有抑制生长作用，细胞的数量减少，核固缩。结论何首乌提取物聚酰胺柱层析流分中含有促人脐静脉血管内皮细胞生长的活性物质。
【关键词】 何首乌 聚酰胺柱色谱 人脐静脉血管内皮细胞 MTT比色法 HE染色法
Abstract:ObjectiveTo investigate the proliferation effects on human umbilical vein vascular endothelial cells(HUVECs)of the fractions isolated from Polygonum multiflorm Thunb extracted with polyamide column chromatography. MethodsThe activity of promoting HUVECs growth of each fraction was observed by MTT colorimetric assay. The changes of HUVECs morphology were observed by HE stain. ResultsThe fractions eluted from polyamide column chromatography had different proliferation activities on HUVECs. With the increase of concentration，the fraction D could promote the growth and proliferation of HUVECs significantly. The cells showed morphological change significantly under microscope. Compared with the control，the cell quantity and mitosis of the fraction D were increased. However， there was little or no effects on the proliferation of HUVECs by fraction B and C. In contrast， fraction A had an inhibitory effect on the growth of HUVECs ， which caused the decrease in the cell number and karyopycnosis. ConclusionThere are some components of promotion growth of HUVECs in the fraction from polygonum multiflorm Thunb.
Key words: Polygonum multiflorm Thunb.； Polyamide column chromatography； Human umbilical vein vascular endothelial cell(HUVEC)； MTT colorimetric assay； HE stain
何首乌Polygonum multiflorm Thunb.系蓼科植物何首乌的干燥块根，具有乌须发、悦颜色、补肝肾、抗衰老之良效［1］。现代药理学研究表明其醇提或水提液具有提高免疫力、抑制血小板聚集、舒张血管、抗氧化等作用，且这些作用与其中的活性成分二苯乙烯苷（2，3，5，4＇-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside）有关［1，2］。二苯乙烯苷又称芪多酚，属多羟基芪类化合物，现代药理学研究表明，其具有清除自由基［2］、降低胆固醇［3］、保护肝脏等［4］作用。本实验采用MTT法和HE染色法观察何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响，为何首乌的进一步开发和利用提供依据。
1 材料与仪器
1.1 材料
聚酰胺（60～80目）和聚酰胺薄膜（10 cm×10 cm）购于浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂；何首乌饮片购自广西医药公司；人脐静脉血管内皮细胞购自武汉大学保藏中心。
1.2 仪器
RE-52型旋转蒸发仪(上海博通)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；紫外线检出器(日本)；二氧化碳培养箱(Thermo Forma MODEL 3111)；Σ960酶标仪；倒置相差荧光显微镜（Olympus CXZIFSZ）；生物显微镜（日本Olympus）。
1.3 试剂乙醇；丙酮；甲醇(成都市科龙化工)；冰乙酸(上海实意化学试剂有限公司)；无水乙醇(重庆川江化工)；氯仿(广东省化学试剂工程技术研究开发中心)，以上试剂级别均为分析纯。RPMI1640培养基（GIBCO Invitrogen cooperation）；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。
自配试剂 ：2%三氯化铁-2%铁氰化钾显色剂；0.5%胰蛋白酶溶液；PBS；苏木精染液；伊红染液及1%稀盐酸乙醇溶液。
2 方法
2.1 何首乌流分提取分离取2 kg何首乌粉用4倍量70%乙醇回流提取，浓缩后的总浸膏依次采用环己烷、醋酸乙酯、正丁醇分别进行萃取。采用聚酰胺柱层析法，以蒸馏水-乙醇为洗脱剂对正丁醇层浸膏进行分离，收集各流分；点样，在365 nm处用紫外灯观察，并以2%三氯化铁-2%铁氰化钾显色跟踪检测，合并相同流分，减压浓缩。按洗脱顺序分别得到A，B，C，D流分组。
2.2 活性研究
2.2.1 细胞的培养人脐静脉血管内皮细胞培养于含体积分数为10%热灭活新生牛血清的培养液中，置二氧化碳培养箱，在37℃，5％CO2条件下培养。
2.2.2 MTT法测定细胞生长增殖实验取指数生长期细胞用0.5%胰蛋白酶消化，加入含小牛血清的培养液计数并稀释至1×104个/ml。将稀释的细胞悬液按100 μl/孔接种至96孔板，置37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h至细胞贴壁后，选择A，B，C，D 4种流分，每组设5个浓度梯度加入至96孔板中，每个浓度设3个平行孔。同时设PBS空白对照组6孔，继续培养72 h，取出孔板，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT，37℃、5%CO2条件下孵育4 h，弃尽孔内液，每孔中加入200 μl的DMSO溶解MTT产物。振荡30 s，用酶标仪于490 nm处测定每个孔的吸光值A值。计算存活率：细胞存活率(%)=(用药组平均A值/对照组平均A值)×100%
2.2.3 HE染色法观察流分对人脐静脉血管内皮细胞形态的影响取贴壁生长的细胞，用0.5%胰蛋白酶消化，加入含小牛血清的培养液计数并稀释至1×104个/ml。 将稀释的细胞悬液按2 ml/孔接种至6孔板，加入已高压灭菌的盖玻片，培养24 h后，加入不同浓度的流分，药物组设定如下：A流分组、D流分组，每组设两个浓度梯度，每个浓度设2个平行孔；同时设2孔空白对照组。培养24 h后，取出盖玻片。用95％乙醇固定，苏木精及伊红染色，乙醇脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片，摄像。
3 结果
3.1 MTT实验结果不同浓度的流分分别作用于人脐静脉血管内皮细胞后，采用MTT法测定其对细胞生长的作用。其中流分D对人脐静脉血管内皮细胞的生长具有促进作用，出现明显的量效关系，即浓度越高，存活率越高。流分A对人脐静脉血管内皮细胞具有一定的抑制生长作用。流分B，C与对照组比较，基本无差异。结果见表1。
表1 何首乌提取物4种流分对人脐静脉血管内皮细胞生长的作用(略)
3.2 细胞形态学改变经HE染色后显微镜观察，可见正常的人脐静脉血管内皮细胞呈梭形，细胞浆丰富，均匀，细胞核规则，呈紫蓝色，核内染色均一。A流分组对细胞具有抑制作用，光镜下观察到细胞的数量减少，部分细胞特别是高浓度组出现胞浆减少，核固缩现象。D流分组对细胞具有明显的促进生长作用，尤其是高浓度组表现为细胞生长旺盛，核分裂相增多，细胞数量增多。见图1。
4 讨论
聚酰胺是通过己内酰胺聚合而成的尼龙-6（锦纶、卡普隆）及由己二酸与己二胺聚合而成的尼龙-66，是一种白色多孔非晶型粉末，其分子中含有丰富的酰胺基，可与多酚类化合物的羟基（或羧基）形成分子间氢键而将其吸附。分子中酚羟基数目越多，芳香化程度越高的化合物与酰胺基的结合力越强，从而实现与其它物质的分离［5］。结合本文MTT法结果可以知道，较晚洗脱出来的流分D，对人脐静脉血管内皮细胞具有促进增殖生长作用，推测流分D中促进血管内皮细胞生长的物质可能与含有酚羟基数目较多有关。但要确定酚羟基是否为促人脐静脉血管内皮细胞生长的药效团有待进一步研究。
血管内皮细胞在维持血管张力和血流调节方面发挥重要作用，内皮细胞还可以阻止血小板和白细胞的激活，所以完整的内皮系统在维持血管稳定和防止血栓方面发挥重要作用。临床实践证实中药何首乌提取物对生物体多种代谢活性具有积极的影响作用。本实验结果表明，在何首乌醇提物的正丁醇萃取物中含有对血管内皮细胞增殖产生促进作用的活性物质，可使细胞的分裂相增多，染色质丰富，为进一步从何首乌中分离纯化具有保护和修复血管内皮细胞的活性物质提供了依据。
【参考文献】
［1］李玉芳，何玄华.何首乌现代研究进展［J］.中成药，1997，19(5):37.
［2］Ryu G，Ju JH，Park YJ，et al. The radical scavenging effects of stilbene glucosides from Polygonum multiflorum［J］.Arch Pharm Res，2002，25(5):636.
［3］Arichi H， Kimura Y， Okuda H，et al. Effects of stilbene components of the roots of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. on lipid metabolism［J］.Chem Pharm Bull (Tokyo). 1982 ，30(5):1766
关键词：细胞生物学；教学问题；改革；自主学习
一、分析教学存在的不足
（一）实验教学安排的时间过少。在传统的课堂教学中细胞生物学主要强调理论教学，很少结合实验教学，即使部分结合实验教学，但采用的方式过于死板，对学生来说理论教学是就是固定不变的，同时实验操作与所观察的实物又非常有限，导致很难将抽象的理论形象化，增大了对理论知识熟练掌握的难度。因此，如果能改变一下教学手段，如播放一些实验操作的录像，让学生观看一些具体的实物，播放一些flash动画，让学生对所学的知识形象化，最后让学生在实际的实验操作中加深印象，这样就能使枯燥的理论知识更容易被理解和掌握。
（二）教材内容的陈旧。细胞生物学是一门不断发展，更新的学科。传统的教学中使用的教材有些内容过于繁杂，没有突出重点内容。而教师在授课过程中没有及时更新，在讲授基本知识时，传输给学生的只有书本知识。此外，不能适当结合自己的科研进展，致使授课内容缺乏先进性和启发性，进而使学生们缺乏兴趣听课，课堂教学效率自然非常低。
（三）学生的自主学习能力差，做不到课前预习课后复习。假使一切的外在条件都达到了，学生不去主动学习，单靠老师课上几十分钟的教学还是不够的。学生要提前预习，在预习中将所遇到的问题带到课堂上来，缩短老师课上的基础教学时间，这样学生所获得的知识点和内容肯定也就更多更广。课后复习，把所学的知识整理，归纳、总结。就算过去很久的时间，回头看看笔记，也能回顾起曾经学习的相关内容。
（四）缺少该学科的比赛。都说团结协作能创造新的天地。每位学生掌握的程度不一样，或者说，每位教学老师所突出的领域不一样，致使学生所拓展的内容不一样。所以，创办该类型的比赛，让学生之间交流，让老师之间交流，指导老师去探索，去传授，而比赛要求能让学生去挖掘新天地。知识竞赛换来的只会是对知识的了解，如果能通过实验结合，让他们自己去挖掘，也许是给学校带来创造诺贝尔生物学奖的一线生机。
二、展望生物学未来的措施
（一）鼓励学生适当去实验室做实验，同时放映一些细胞生物学教学录像，让学生轻松感性地学习。每门课都是坐在教室，听课做笔记，学生多少有点想偷懒的心思。为了使课堂教学改革顺利进行，可以引进教学录像片，如显微镜的使用、肿瘤细胞发生，细胞的分化、细菌的分离与纯化方法、细胞的生理化反应、物质的跨膜运输等。在整个教学过程中，按照教学目标和教学对象的特点选择合理的文字、图形、图像、声音等多媒体信息要素，并利用计算机技术对其进行辅助教学，为学生创设多样化的课堂教学情境，把抽象性的、阐述性的教学内容转变为具体的、生动形象的感性素材，通过增强和丰富教学过程的外部刺激，从而达到提高教学质量的目的。在细胞生物学课程的讲授过程中，需要采用大量的图片、动画、影片等，以多媒体课件的形式进行展示，再加上讲述时进行生动的描述和设置一些启发式的问题，能极大地激发学生的听课兴趣，产生很好的教学效果。
（二）教学与科研相结合。教材里的内容是有限的，每位教师都不能单纯地搞教学而脱离科学研究工作。只有长期参加科研实践的教师，才能使所授课程的内容更加具有前沿性、独创性和启发性。例如在介绍细胞分化时，将肿瘤细胞的研究进展及干细胞的分化联系起来，在授课过程中插入细胞培养的方法、肿瘤细胞及干细胞的研究思路、实验过程，以及最终获得的实验结果，将理论与实践相结合起来，更加贴近实际，不仅通俗易懂，而且大大激发了学生听课的兴趣，同时也培养了学生解决实际问题的能力。
（三）引导学生自主学习。传统的教学形式存在一些不足之处，如课堂上，教師只顾自己讲，学生只顾听，师生之间没有情感交流，缺少互动，常此以往，学生容易觉得听课乏味，从而失去听课的兴趣。相反，如果教师在准备课程时，布置一些问题让学生去思考，课堂上给予一定的时间和机会进行充分研讨，甚至让学生自己走上讲台去试讲，去发表各自的观点，锻炼学生们的表达能力和独立思考能力，让学生们积极、认真、充分地参与课堂教学过程。通过对学生课前预习的了解，掌握学生对新知识点的不足，对症下药，这样既可以充分调动学生听课的积极性，又可以提高老师讲课的热情，发挥老师的特长。
（四）荣誉能使人进步。创办小规模的比赛，设立不同的奖项，学生之间存在竞争，适者生存，他们就会向更深层次的方向探索。再来大规模的比赛，既可以使来自不同地方的学生相互交流，发现不足，也可以促进教师之间科研的交流。不把教学当成一项任务，把它当作是探索。这样不仅使老师有兴趣，学生也是兴致勃勃。
三、结束语
细胞生物学是一门不断发展，不断更新的学科，当今教学道路上，学生才是主体，教师在今后的教学上必须充分结合学生的兴趣爱好去拓展，充分挖掘学生的潜能，变潜能为能力。只有不断的发现问题与弊端，丰富教学内容，改革教学方法，才能找出适应学生的教学方式，才能更好的传输知识，拓展学生的知识面，从而显著提高教学质量与教学效果。
参考文献：
[1]杨琳，张武，阿周存，苏锡钧.《细胞生物学》实验教学改革刍议[J].吉林农业，2017（16）.
[2]翟中和.我对写《细胞生物学》教材的一些想法[J].高校生物学教学研究（电子版），2013（01）.
作者：袁源 王媛丽 杨树源 韩忠朝 张晓辉
［摘要］目的 探讨人脐带间质干细胞（MSC）的分离、纯化、扩增方法，研究其基本生物学特性。方法 无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带，分别用组织块贴壁法和酶消化法获取脐带间质干细胞，进行原代培养。应用DMEM/F12培养液进行纯化和扩增培养。用流式细胞仪检测MSC的细胞表面标志。绘制细胞生长曲线并测定细胞周期。结果 两种分离方法均可获得MSC，原代培养12～14 d后可达90%融合，细胞可传代20代以上。流式细胞仪检测结果显示，脐带MSC强表达CD13、CD29、CD44、CD105，弱表达CD106，不表达CD34、CD11a、CD14、CD31、CD45。结论 脐带MSC在体外有较强的增殖能力，可作为组织工程的种子细胞。
［关键词］ 脐带;间质干细胞;生物学;细胞分离
［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the isolation， purification and expansion method of human umbilical cord derived mes-enchymal stem cells （UCMSC）. MethodsThe umbilical cords from cesarean newborns were collected in sterile condition. Me- senchymal stem cells were obtained by enzyme digest method and cultured in DMEM/F12 medium. Surface antigens of UCMSC were detected by FACS. The cell growth curve and cell cycle of UCMSC were analyzed. ResultsMSCs could be obtained by both of the two methods. After 12-14 days of primary culture， isolated MSCs reached 90% confluence and the cells could expand at least 20 passages. FACS analysis showed that UCMSCs were positive for CD13， CD29， CD44， and CD105 and negative for CD106， CD34， CD11a， CD14， CD31， and CD45. ConclusionUmbilical cord derived MSCs has strong proliferation capacity， which can be used as the seed cells for tissue engineering.
［KEY WORDS］umbilical cord; mesenchymal stem cell; biology;cell separation
间质干细胞（MSC）是最早由FRIEDENSTEIN发现，存在于骨髓中的一类成体干细胞，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞，是细胞工程重要的种子细胞之一［1］。近年来，国内外多个实验组报道了骨髓MSC（BMMSC）体外特定条件下能转化为神经元样细胞，使BMMSC受到了越来越多的关注［2］。但在临床上，骨髓取材较困难，供体有限，随年龄增长BMMSC增殖能力、多向分化能力下降，且有病毒污染的可能［3］。这些限制了BMMSC的进一步临床应用。寻找其他来源的MSC成为近年来的研究热点。新近有研究报道MSC不仅存在于骨髓，还存在于外周血，尤其是脐带血，更有研究报道从胎儿肝脏、肺脏、肾脏等部位提取到了MSC［4］，表明MSC 不仅存在于血液系统，也存在于实质组织内。但脐带血MSC含量稀少，分离极其困难，胎儿MSC的应用则受到伦理学的限制。脐带血及胎儿内脏均存在MSC，脐带作为新生儿的一部分并且是分娩废弃物，其中是否也含有并能否提取到足量的MSC引起本研究室的关注。本文拟探讨从脐带获取MSC的方法及其基本生物学特性。
1 材料和方法
1.1 材料 脐带组织取自天津市中心妇产医院剖宫产足月新生儿，均经父母授权同意。主要试剂和诱导剂:DMEM/F12培养液（Hyclone公司）、胎牛血清（Fe-talbovineserum，中国医学科学研究院血液病研究所）、碘化丙啶（BD公司）、胶原酶Ⅳ（Sigma公司）、BrdU（Sigma公司）、兔抗人BrdU抗体（北京中杉生物技术公司）、SP试剂盒（北京中杉生物技术公司）、流式抗体（除FITC-CD105购自Ancell公司，其余均购自美国BD公司）。RT-PCR试剂购自Invitro-gen公司，引物由上海博亚生物公司合成。
1.2 脐带MSC的分离 采用了两种脐带MSC的分离方法，分别是组织块贴壁法和胶原酶消化法。
1.2.1组织块贴壁法 将脐带从手术台上取下，无菌条件下浸入DMEM/F12培养液中，4 ℃保存，超净台内取出脐带，PBS冲洗，冲去脐静脉及动脉内的残存血。将脐带剪碎至1 mm3 大小组织块。组织块接种于含DMEM/F12培养液（含体积分数为0.1的FBS，25 mmol/L谷氨酰胺，105U/L青霉素，100 mg/L链霉素）50 mL的塑料培养皿中，放置于37 ℃、体积分数0.05的CO2 饱和湿度的孵箱内培养。1周后，去掉组织块更换培养液。以后每 3 d 换液1次。细胞长到80%融合时，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L的EDTA混合液消化（在显微镜下控制消化时间），以8.0×103 /cm2 的密度接种于传代培养瓶（T-25）中进行扩增培养。
1.2.2胶原酶消化法 开始同组织块贴壁法，脐带剪碎至1 mm3 大小组织块后转移至1 g/L胶原酶Ⅳ中，37 ℃持续搅拌消化30 min，随即用1 g/L胰酶37 ℃持续搅拌消化30 min。细胞筛过滤，滤液离心，PBS洗2次。以1.0×106 /cm2 的密度接种于含DMEM/F12培养液（含体积分数为0.1的FBS，25 mmol/L谷氨酰胺，105U/L青霉素， 100 mg/ L链霉素）的T-25塑料培养瓶中。3～4 d后更换培养液，去掉未贴壁细胞。以后每3 d换液1次，至细胞融合传代。
1.3 细胞表面分子标志检测 分别取第3、5、10代的脐带MSC，去掉培养液，PBS洗2次，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，PBS洗涤后制成浓度为3.0×109 /L的单细胞悬液，每个Ep-pendof管加100 μL细胞悬液，共12个管。1号和2号管为阴性对照，分别加入5 μL抗鼠的IgG1-FITC和IgG1-PE单克隆抗体（单抗）;其余10管分别加入抗人的CD13-PE、CD14-FITC、CD31-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD11a-PE、CD29-PE、CD105-FITC、CD106-PE以及Cy-chrome-HLA-DR单抗各 5 μL 。4 ℃孵育30 min，流式细胞仪检测。
1.4 细胞增殖能力测定
1.4.1细胞生长曲线 分别取原代及第2、6、12代脐带MSC，调整细胞密度至4×107 /L，接种至24孔板。第2天起每天取3孔进行细胞计数，取平均值。连续测8 d，绘制细胞生长曲线。
1.4.2BrdU掺入实验 BrdU可以随细胞分裂在S期进入细胞核DNA，并标记细胞，可以将其作为判断细胞增殖能力的指标。细胞传代后，将BrdU以 200 μmol/ L加入培养液。48 h后，行BrdU免疫组化染色检测其标记率。
1.5 克隆形成能力的测定 取培养的第2代脐带MSC制成细胞悬液，计数后吸取适量接种于6孔板，调整孔内细胞密度为10/mm2 ，3 d换液1次，7 d后取出6孔板，PBS洗涤后用姬母萨染液染色，计数孔中的集落数，计数标准为50个细胞以上者计为1个集落。
1.6 RT-PCR检测 分别取3×106 个第3代UCMSC，以Trizol提取总RNA，逆转录为cDNA，反应体系含2 μg总RNA，25 mg/L随机引物，0.5 mmol/L dNTP， 1.5 mmol/L MgCl 2 ，10 mmol/L DTT，1×buffer和2 μL M-MLV。PCR法检测OCT-4 mRNA表达。引物序列Primer 1: 5′-GAGTCCCAGGA-CATCAAAGC-3′，Primer 2: 5′-CTTCCTCCAC-CCACTTCTGC-3′。PCR产物序列长度228bp。PCR反应条件为94 ℃ 45 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s ，共30个循环。
1.7 细胞周期测定 分别取第3代及第8代脐带MSC，消化后离心，PBS洗涤2次。50 mg/L碘化丙啶标记细胞， 100 mg/L 的RNA酶处理。行流式细胞术检测细胞周期。
1.8 透射电镜观察脐带MSC的形态和超微结构 将生长良好的第3代脐带MSC用2.5 g/L胰酶消化后，PBS清洗，2000 r/min离心10 min，以体积分数为0.02的戊二醛固定，透射电镜下观察。
2 结果
2.1 脐带MSC的分离、纯化及扩增 用组织块贴壁法分离脐带MSC，1周后于组织块间隙已可见散在分布的长条索状纺锤形细胞（图1）。此时，去掉组织块，更换培养液。倒置显微镜下可见几个或十几个散在分布、贴壁生长的细胞集落。每个集落细胞数从十几到几十个不等，细胞形态与骨髓来源MSC相似，多为两个突起的长梭形或扁平形的成纤维样细胞，少量为多突起的星形样细胞。细胞折光度好，核仁明显，胞体较骨髓MSC稍宽 大。2周后，每个细胞集落细胞数达到上百个或数百个。细胞形态渐变为均一的纺锤形。3周左右细胞达到80%融合。此时以2.5 g/L胰酶消化，按 1∶ 3的比例传代。传代后的细胞约每3 d即可达到90%～95%融合，需再次传代或冻存。用胶原酶消化法分离脐带MSC，第2天即看见有少量形态各异的贴壁细胞，散在分布（图2）。1周左右时，贴壁细胞形成集落，占优势的是成纤维样细胞，此外还可见少量鹅卵石样细胞组成的集落，考虑为脐静脉内皮细胞。成纤维样细胞增殖能力旺盛，至2周左右可达到80%融合，脐静脉内皮细胞生长则受到明显抑制。2.5 g/L胰酶消化，传代后可得到纯化的成纤维样细胞（图3）。传代后的细胞形态无明显变化，性质稳定。每根脐带经2周左右原代培养结束时可获得6.5×105 个细胞，至少能体外培养4个月，传20代以上，扩增3×109 倍。
2.2 免疫表型测定 分别对第3、5、10代脐带MSC行FACS检测。结果表明各代间免疫表型无明显差异，均强烈表达CD13、CD29、CD105、CD44，弱表达CD106，不表达CD14、CD34、CD11a、CD31、CD45。
2.3 增殖能力及细胞周期检测 本实验选择原代培养及第2、6、12代脐带MSC的生长曲线进行观察比较，发现不同代数细胞具有以下共同特征:培养潜伏期12～24 h，2 d后进入对数生长期，对数增殖期持续4～5 d，7～8 d后长满瓶底，进入细胞生长平台期，生长停止，12代以内各代间增殖能力无明显差别（图4）。取对数生长期，按照以下公式计算细胞倍增时间:DT= t ×log2/（logNt-logN0 ）。结果表明，第2、6、12代MSC倍增时间分别为33.1、34.4、34.6 h。在BrdU掺入实验中，80%～90%细胞BrdU表达阳性，表明细胞有丝分裂旺盛，增殖能力强。流式细胞仪进行细胞周期检测表明，第3代和第8代脐带MSC细胞周期比较无明显差别，均为有80%～90%细胞处于G0 ～G1 期，表明细胞增殖活跃。该结果与骨髓及脐血MSC结果一致。
2.4 脐带MSC克隆形成能力测定 低密度接种到6孔板后，脐带MSC可形成散在分布的克隆，克隆大小形态各不相同。按以下公式计算克隆形成率，克隆形成率=平均克隆数/种入的单个细胞数×100%。本文结果表明，第2代脐带MSC克隆形成率为21.25%。2.5 RT-PCR检测结果脐带MSC的OCT-4 mRNA表达阳性（图5）。2.6 超微结构观察 透射电镜观察显示脐带MSC核大，不规则，核仁明显，常染色质多，异染色质少;胞浆少，有少量细胞器，以粗面内质网和线粒体为主，胞浆内有较多游离核糖体（图6）。
3 讨论
干细胞是指一类具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞。依据其来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是全能干细胞，理论上能分化为各种成体细胞，但其研究受到伦理学及法理的限制，且因胚胎干细胞的原始特性，其存在潜在致瘤性的危险。近期研究表明，部分成体干细胞也具有跨系甚至跨胚层分化能力。如神经干细胞可转化为造血干细胞，骨髓基质细胞分化为神经样细胞［5，6］。这些研究为成体干细胞的细胞替代治疗及组织工程研究打下了基础。近年来，MSC的概念越来越引起人们的重视。MSC最初是特指骨髓基质细胞，后来研究发现，在胎儿肝脏、肺脏、心脏等实质脏器及脐带血中均提取到了与骨髓基质细胞生物学特性相似、免疫表型相同的干细胞。因此将间质组织来源的与骨髓MSC生物学性状相似，具有多向分化潜能的细胞统称为间质干细胞［7］。MSC因其扩增迅速，免疫原性低，易于转染外源基因等优点使其成为组织工程最理想的种子细胞。本研究在脐带中提取到的细胞增殖能力强，形态及生理学特征与骨髓MSC相似。RT-PCR检测示OCT-4 mRNA表达阳性，OCT-4是胚胎干细胞特异性基因，对维持干细胞未分化状态具有重要作用［8］，表明脐带MSC具有干细胞特性。流式细胞检测结果显示，脐带MSC强烈表达CD13、CD29、CD105、CD44，弱表达CD106，不表达CD14、CD34、CD11a、CD31、CD45。CD29属于整合素家族，CD105是间充质相关抗原，CD14是单核巨噬细胞表面标志，CD11a是淋巴细胞功能相关抗原1α链，CD34和CD45是造血干细胞阳性标记，CD31是内皮细胞特异性抗原标记。本实验结果表明，脐带MSC表达间充质细胞特异性抗原标志而不表达造血干细胞、内皮细胞特异性抗原。这与骨髓、脐血、胎肺等其他组织来源的MSC流式细胞检测结果一致。目前尚未明确间质干细胞的特异性抗原标志，通常以细胞形态、流式细胞检测结果、多向分化潜能作为判断标准。我们据此认为脐带分离到的贴壁细胞也属于MSC，表明除骨髓、胎儿脏器外，MSC还存在于新生儿脐带组织。脐带中分离出MSC的重要意义在于，脐带作为分娩废弃物，来源广泛，取材方便，不受任何伦理及法理的限制。而本研究建立的分离培养方法更能高效、快速、大量地扩增MSC，这又是脐血源性干细胞所不能比拟的。已有研究证实，在脐带的连接组织Whartonjel-ly中分离出的细胞在特定条件下能分化为软骨细胞或神经样细胞，并表达神经烯醇化酶（NSE）等神经元特异性抗原。表明脐带来源的干细胞具有多向分化潜能，可以作为细胞替代治疗的种子细胞。本实验建立了相对成熟、稳定的体外分离培养、扩增脐带MSC的方法，有助于获得大量的MSC作为进行细胞治疗、基因治疗的靶细胞，以及组织工程研究的种子细胞，并为MSC最终应用于临床治疗奠定了理论基础。
（本文图1～6见封二）（略）
［参考文献］
［1］ PITTENGER M F， MACKAY A M， BECK S C， et al. Mul-tilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］. Science， 1999，284（5411）:143-147.
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［3］ RAO M S， MATTSON M P. Stem cells and aging: expanding the possibilities［J］. Mech Ageing Dev， 2001，122（7）:713-734.
［4］ ANKER P S， NOORT W A， SCHERJON S A，et al. Mesen-chymal stem cells in human second-trimester bone marrow， liver， lung， and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogeneous multilineage differentiation potential［J］. Haematologica， 2003，88（8）:845-852.
［5］ BJORNSON C R， RIETZE R L， REYNOLDS B A， et al. Turning brain into blood:a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo［J］. Science， 1999，283（5401）:534-537.
［6］ WOODBURY D， SCHWARZ E J， PROCKOP D J， et al. A-dult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons［J］. J Neurosci Res， 2000，61（4）:364-370.
因此，针对特点版本的教材（人教版新课标教材），对术语、概念的细节进行辨析，从而深化对特异性免疫过程的理解，是突破相关考点的关键。
一、免疫细胞来源的辨析
例1 科研人员为研究脾脏中某种淋巴细胞（简称M细胞）在免疫应答中的作用，进行了如下实验：
[组别＼&处理方式＼&检测结果＼&实验组＼&用肺癌细胞抗原处理M细胞后，分离出M细胞与胸腺淋巴细胞混合培养，在分离出胸腺淋巴细胞与肺癌细胞混合培养＼&部分淋巴细胞能杀伤肺癌细胞＼&对照组＼&未经处理的胸腺淋巴细胞与肺癌细胞混合培养＼&淋巴细胞均不能杀伤肺癌细胞＼&]
下列对该实验的相关分析，不正确的是（ ）
A.实验证明M细胞能够将肺癌细胞抗原呈递给胸腺淋巴细胞
B.经M细胞刺激后部分胸腺淋巴细胞增殖分化形成效应细胞
C.实验组培养液中含有能增强效应T细胞杀伤力的淋巴因子
D.实验组培养液中含有能特异性识别肺癌抗原的免疫球蛋白
解析 从实验操作分析，是否用抗原处理后的M细胞，与胸腺淋巴细胞混合培养，导致胸腺淋巴细胞能否杀死肺癌细胞，说明M细胞能呈递抗原，辅助活化胸腺淋巴细胞，故A项正确；从免疫细胞的形成条件分析，胸腺中成熟的淋巴细胞是T细胞，在抗原的刺激下，能够分泌淋巴因子、增殖分化成效应T细胞，故B项、C项正确；而能分泌免疫球蛋白――抗体的浆细胞，由B细胞增殖分化形成，B细胞是来自骨髓的淋巴细胞，不是胸腺淋巴细胞，故D项错误。
答案 D
点拨 免疫调节中涉及吞噬细胞、B细胞、T细胞、浆细胞、效应T细胞、记忆细胞等免疫细胞，这些免疫细胞的来源如下图：
①来源：免疫细胞的根本来源都是造血干细胞。在初次免疫中浆细胞、效应T细胞直接来自B细胞或T细胞；在二次免疫中浆细胞、效应T细胞不仅直接来自B细胞或T细胞，还可以来自记忆细胞。记忆细胞来自B细胞或T细胞。
②场所：吞噬细胞、B细胞在骨髓中发育，T细胞需要在胸腺中发育。
③条件：吞噬细胞、B细胞、T细胞的形成都不需要抗原的刺激；浆细胞、效应T细胞、记忆细胞的形成需要抗原的刺激。
④实质：形成各种免疫细胞的增殖分化过程中，细胞的遗传物质并未发生改变，只是发生了基因的选择性表达。
二、免疫细胞功能的辨析
例2 若H7N9禽流感病毒侵入人体，机体在免疫应答过程中不会发生的是（ ）
A.吞噬细胞摄取和处理病毒
B.T细胞合成并分泌淋巴因子
C.浆细胞进行分裂并分泌抗体
D.B细胞增殖分化形成记忆细胞
解析 H7N9病毒对人体来说属于一种特异性抗原，侵入人体后会激发人体的特异性免疫反应。在特异性免疫中，吞噬细胞能摄取、处理和呈递抗原，故A项正确；T细胞能分泌淋巴因子，故B项正确；B细胞能增殖分化形成浆细胞和记忆细胞，故D项正确；浆细胞能分泌抗体，但已高度分化，不具有分裂能力，故C项错误。
答案 C
点拨 在免疫调节中，免疫细胞具有不同的功能，概括如下表：
[免疫细胞＼&具体功能＼&识别抗原能力＼&分裂能力＼&分泌功能＼&吞噬细胞＼&识别、摄取、处理和呈递抗原；吞噬消化＼&非特异性识别＼&＼&溶菌酶＼&B细胞＼&识别、增殖分化＼&特异性识别＼&形成浆细胞和记忆细胞＼&＼&T细胞＼&识别、增殖分化；
产生淋巴因子＼&特异性识别＼&形成效应T细胞和记忆细胞＼&淋巴因子＼&浆细胞＼&产生抗体＼&不识别＼&＼&特异性
抗体＼&效应T细胞＼&识别、直接接触靶细胞＼&特异性识别＼&＼&＼&记忆细胞＼&识别、增殖分化＼&特异性识别＼&形成浆细胞或效应T细胞＼&＼&]
①在各种免疫细胞中，浆细胞是唯一不识别抗原的；吞噬细胞是识别抗原的细胞中，唯一不识别抗原特异性的；效应T细胞和记忆细胞只识别特定的抗原。
②B细胞和T细胞受到抗原刺激后，增殖分化都分别形成两种细胞。记忆细胞增殖分化形成浆细胞或效应T细胞，取决于记忆细胞本身的来源。
③B细胞、浆细胞只参与体液免疫；效应T细胞只参与细胞免疫；T细胞、记忆细胞参与体液免疫、细胞免疫；吞噬细胞参与非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫。
三、相关物质的辨析
例3 将小鼠B细胞注入家兔体内，产生免疫反应后，家兔血清能使小鼠T细胞凝集成细胞集团。而未经免疫的家兔血清不能使小鼠T细胞凝集成团。T细胞凝集现象的出现是因为（ ）
A.小鼠B细胞诱导家兔产生细胞免疫
B.小鼠T细胞诱导家兔产生体液免疫
C.小鼠B细胞和小鼠T细胞有相同抗原
D.小鼠T细胞和家兔T细胞有相同抗原
解析 注入家兔体内后，小鼠B细胞上的蛋白质等物质相当于抗原，刺激家兔产生免疫反应，在家兔的血清中可以找到相应的抗体。根据抗原和抗体之间的特异性结合特点分析，血清中抗体可以使小鼠T细胞凝集成团，说明小鼠的B细胞和小鼠T细胞具有相同的抗原。
答案 C
点拨 除了免疫细胞，许多物质也参与了免疫调节，最常见的是下列几类物质：
抗原：能够引起机体产生特异性免疫反应的物质，如病毒、细菌等病原体表面的蛋白质等物质，题目中常见的外毒素、内毒素、类毒素、凝集原属于抗原。
抗体：特异性免疫中的免疫活性物质，化学本质是蛋白质，由免疫细胞――浆细胞合成分泌，分布主要在血清、组织液、外分泌液。参与体液免疫，能与特定的抗原发生特异性结合。题目中常见的抗毒素、凝集素属于抗体。
淋巴因子：特异性免疫中的免疫活性物质，由免疫细胞――T细胞合成分泌，参与体液免疫和细胞免疫，促进淋巴细胞的增殖分化和功能。
溶菌酶：非特异性免疫中的免疫活性物质，化学本质是蛋白质，由多种非免疫细胞和免疫细胞合成分泌，分布广泛。参与非特异性免疫，泪液、消化液中的溶菌酶参与第一防线，体液中的溶菌酶参与第二防线。
抗生素：微生物产生的一类物质，能抑制或影响细菌、真菌等病原体的生命活动，作为药物使用，与机体自身的免疫功能无关，不属于免疫活性物质。
要点提示：
①抗原不一定是外来的，自身衰老、破坏、癌变的细胞也可以成为自身免疫反应中的抗原。
②抗原的结构特异性决定了抗体、效应T细胞和记忆细胞的特异性，使抗体、效应T细胞和记忆细胞只能识别特定的抗原。
③免疫活性物质不都具有特异性，不都由免疫细胞分泌。
四、体液免疫与细胞免疫的辨析
例4 下图所示实验能够说明（ ）
[LCM病毒][被LCM病毒感染的51Cr标记的同种小鼠细胞][分离淋巴细胞][测定上清液中51Cr释放量][4小时后][培养][4～5天后][加入][加入]
A.病毒抗原诱导B细胞分化的作用
B.浆细胞产生杭体的作用
C.病毒刺激淋巴细胞增殖的作用
D.效应T淋巴细胞的作用
解析 只有被LCM病毒感染的小鼠细胞发生破裂，才会释放细胞内的51Cr标记物，因此测定上清液中51Cr释放量，可以表明靶细胞的破裂，该过程是细胞免疫的结果，发挥作用的是免疫过的小鼠体内分离得到的效应T细胞，故D项正确、A项、B项错误；LCM病毒是作为抗原物质刺激小鼠，使其体内的T细胞发生增殖、分化，形成相应的效应T细胞和记忆细胞，强调的是分化出效应T细胞，故C项不准确。
答案 D
点拨 体液免疫和细胞免疫相互区别、同时彼此联系。正确区分两种方式，能迅速把握题目的考查对象。
[免疫
类型＼&体液免疫＼&细胞免疫＼&抗原
类型＼&细胞外的抗原＼&细胞内的抗原＼&作用
主体＼&抗体＼&效应T细胞＼&作用
对象＼&细胞外的特定抗原＼&特定靶细胞＼&作用
方式＼&抗体与抗原结合＼&效应T细胞直接接触靶细胞＼&作用
效果＼&抑制病原体的繁殖或黏附，形成沉淀、细胞集团，被吞噬、消化＼&靶细胞裂解死亡，病原体失去寄生基础，从而被吞噬、消化＼&参与
细胞＼&吞噬细胞、T细胞、B细胞、记忆细胞、浆细胞＼&吞噬细胞、T细胞、效应T细胞＼&参与
物质＼&淋巴因子、抗体＼&淋巴因子＼&]
要点提示：
①吞噬细胞、T细胞、淋巴因子参与了两种特异性免疫，判断时应从两种免疫的区别入手。
②两种特异性免疫相互配合共同发挥免疫效应，如：对付病毒感染，先体液免疫阻止病毒经血液循环而播散，再由细胞免疫消灭靶细胞。
1.无胸腺裸鼠是一种无毛变异小鼠，先天性无胸腺，常作为医学生物学研究中的实验动物。下列表述中错误的是（ ）
A.无胸腺裸鼠具有正常的体液免疫功能
B.无胸腺裸鼠应饲养在无菌环境中
C.无胸腺裸鼠对异体组织无排斥反应
D.人类癌细胞可在无胸腺裸鼠体内增殖
2.某人因过量注射美容制剂而出现头昏、站立不稳等症状。经医生诊断后，医生为其注射了肉毒杆菌抗毒素进行治疗，目的是（ ）
A.中和体内的肉毒杆菌外毒素
B.中和体内的肉毒杆菌凝集素
C.刺激机体产生特异性抗体发挥体液免疫作用
D.刺激机体释放出淋巴因子发挥细胞免疫作用
3.研究发现两种现象：①动物体内的B细胞受到抗原刺激后，在物质甲的作用下，可增殖、分化为效应B细胞；②给动物注射从某种细菌获得的物质乙后，此动物对这种细菌具有了免疫能力。则这两种物质中（ ）
A.甲是抗体，乙是抗原
B.甲是抗体，乙是淋巴因子
C.甲是淋巴因子，乙是抗原
D.甲是淋巴因子，乙是抗体
4.某种病菌感染人体并侵人细胞内后， 机体可以对该靶细胞产生免疫反应， 其中有（ ）
A.浆细胞接触靶细胞， 导致靶细胞裂解， 从而使病菌抗原被抗体消灭
B.浆细胞接触靶细胞， 导致靶细胞裂解， 从而使病菌抗原被淋巴因子消灭
C.效应T细胞接触靶细胞， 导致靶细胞裂解，从而使病菌抗原被外毒素消灭
1 实验分析要科学、严谨
教材编者注重自主探究能力的培养，有时不把实验分析详细表述出来，编者偏重于整体编写思路，对每一个小局部难以做到精雕细琢，这都会留下了一些思考与分析的空间。所以，教材上的实验分析往往有完善或改进之处，如果照本宣科地进行实验（资料）分析，不一定严谨，可能给学生留下疑惑，达不到理想的教学效果。进行实验分析的教学，教师应该遵循科学性原则先进行严谨、全面的实验分析，找出实验分析的关键点、盲点及拓展方向，然后依据正确的教学策略与教育教学理念进行教学设计，从细节着手巧设疑问、激活思维，引导质疑、猜测、分析、类比、判断。
2 设置有效问题引导实验分析
培养思维能力是进行实验分析的重要教学目标，实现目标的关键是探究问题的有效性。教“细胞核”一节课做“资料1-黑白美西螈核移植实验”的分析时，如果把“资料1”完整呈现后照本宣科地讨论“问题1”，学生能不加深思地做出判断而答出正确答案，思维的深度不够、过程性不强。如果在呈现实验方法之后、呈现结果之前追加一问：在实验结果还未明显显现之前，你预测一下会有哪些可能的结果？可得出什么相应的结论？结果学生答出了“黑色”、“白色”、“灰色”和“斑马色”及对应的结论，其中的“斑马色”可能老师都没有想到。教材的“问题1”有点诱导式提问的嫌疑，不是有效探究问题，追加的这一问，真正引发了学生思维，因为拓展了学生的思维空间、提高了思维强度[1]。进行实验分析的教学时，要注意设置有效问题引起对重要实验现象或结果的质疑与关注、引领学生明确思维的目标指向，从而激活思维，拓展思维空间和突破思维的难点、盲点。
3 依据教学理念与学生素质选择教法
完成哺乳动物红细胞的吸水与失水实验的分析后，设问：如果将成熟的植物细胞置于不同浓度的外界溶液中，成熟的植物细胞会发生怎样的变化？引导将红细胞吸、失水原理迁移到植物细胞，以成熟植物细胞的细胞壁与原生质层的结构与生理特点为据进行分析，探讨预测成熟植物细胞处于不同浓度溶液中时的形态结构变化，启导“发现”质壁分离及其复原现象。这样的教学程序实现了实验情境与结果的迁移，跟先实验后分析的教学程序比较，在训练学生的探究与分析能力方面更有效[2]。先呈现实验结果后分析解释也是一种教法，偏重点不同和学习难度降低，因材施教而已。
4 先做铺垫降低难度
生物学的实验分析，往往要运用数理及化学原理，但其他课程学习某些相关原理比较靠后，因此，在引导进行实验分析之前，要把相关原理交代清楚先做好铺垫。例如分析过氧化氢在不同条件下的分解实验，就要把活化分子和活化能等化学概念与原理交代清楚：化学反应的进行，是常态分子吸收一定的能量后变成的活化分子，单位空间内活化分子的比率增加，活化分子之间的有效碰撞增多，反应速度加快。有些物质分子要吸收较多的能量才能变成活化分子，反应不易进行或速度慢。单位数量的物质由常态分子转变为活化分子需要的能量叫做活化能（J/mol），有些物质在催化剂的作用下改变了化学反应的途径，降低了活化能，使常态分子容易变成活化分子。
乙组与甲组比较，H2O2在加热的条件下可以分解，是H2O2在加热的条件下获得了了能量，获得一定能量后的H2O2分子变成了活化分子，能够进行化学反应。丙组加入FeCl3溶液，丁组加入的肝脏研磨液（过氧化氢酶）不能使H2O2分子获得能量却能使H2O2分子容易分解，是因为FeCl3和过氧化氢酶改变了反应途径，降低了活化能，使H2O2由常态分子转变为能够进行反应的活化分子需要的能量变少。丁组的反应速度显著比丙组快，说明过氧化氢酶降低活化能的效果比FeCl3更显著，在过氧化氢酶作用下，单位空间内活化分子的数量更多，过氧化氢酶的催化效率更高。
如果不先做活化分子与活化能方面的铺垫，引导学生进行实验分析，只能是教师唱独角戏。所谓的实验分析，难以使学生获得深刻的体验体会，很可能就成了以实验情境承载知识结论的传授课。不过，对于基础较差的学生也没有必要把问题搞得太复杂。
5 改变实验条件后引导重新预测分析
按教材要求完成正常的实验操作并获得结果后，提出假设改变实验的部分条件，让学生预测分析条件改变后的实验结果，能够强化学生对实验原理与操作的认识。例如完成提取叶绿体中的色素实验后，提出以下问题供学生思考：（1）如果某同学在提取色素的过程中忘了在研钵中添加CaCO3，他提取的色素溶液的颜色是怎样的？（2）如果某同学用水稻的叶黄素缺失突变体做色素提取实验，将其叶片进行了红光照射光吸收测定和色素层析条带分析（从上至下），与正常叶片相比，实验结果将是怎样的？（光吸收差异不显著，色素带缺第2条）
【关键词】 血细胞
【摘要】 目的 探讨用新鲜血代替校准物对血液细胞分析仪进行校准。 方法 以Abbott CD-3200为校准参考仪器，用新鲜血液作为校准品，校准本室Abbott CD-1700（1）、CD-1700（2）和Act.diff（Beckman Coulter）三台血细胞分析仪。 结果 三台血细胞分析仪与校准参考仪器的各检测指标相关系数（r）均>0.90;新鲜全血的质控偏差结果显示:RDW的最大CV值为2.8%，PLT的最大CV值为4.9%，MPV的最大CV值为14.6%，余各项指标的CV值均<2.0%。 结论 新鲜血可作为校准物;每天对同一实验室不同血细胞分析仪结果进行校准，是保证分析结果的准确度和精密度的有效手段和措施。
关键词 血液 血细胞计数 质量控制
在血液细胞分析仪质量控制过程中，仪器的校正是必不可少的，新仪器安装或每次维修后都应进行仪器的校正。仪器校正液是权威部门认可的标准物质，但只能用于校正同型号的仪器，不能用于其他品牌仪器的校正。血细胞分析的检测结果只有直接或间接地溯源至参考方法，才能保证结果的准确性和不同实验室检测结果的可比性 ［1］ ，最好的校正液是经ICSH推荐参考方法定值的新鲜人体血液。（1）氰化高铁血红蛋白法测定血红蛋白（HGB）;（2）微量红细胞压积法测定红细胞比容（HCT）;（3）微量计数板手工计数RBC和WBC;（4）相差显微镜计数血小板。所有器材都要经过严格校正;该校正液能适合于各种型号的仪器校准之用。但由于血细胞分析检测系统配套校准物的价格高、进口入关手续的办理较难、效期短且难以及时获得等特点，使校准物的使用难以得到推广。此外，一些血细胞分析检测系统无配套的校准物，致使用户无法进行校准。在缺乏理想的多通道血细胞分析仪的质量控制系统的情况下，使用了不同的质量控制品，包括新鲜全血、稳定血液样品、非生物代用品等。血细胞分析是临床最常用的实验室检测指标，其结果的准确性直接影响对患者的诊断和治疗。为了对本室不同的血细胞分析仪测定结果的准确性及可靠性进行分析，我们用物理和化学成分与患者相同EDTA-K 2 抗凝的新鲜全血，代替校准物对血液细胞分析仪进行校准，探讨新的校准品。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器与试剂 Abbott CD-3200血细胞分析仪及进口配套试剂;Abbott CD-1700血细胞分析仪及进口配套试剂;Act.diff（Beckman Coulter）血细胞分析仪及进口配套试剂。
1.1.2 校准物 Abbott CD-3200原装进口配套CELL- DYN系列质控品及校准物，批号R0114A。
1.1.3 标本采集 临床患者新鲜静脉抗凝血2ml（EDTA-K 2 抗凝管）。
1.2 方法 用Abbott CD-3200原装进口配套CELL-DYN系列质控品及校准品对该仪器进行本底测试和高、中、低值质控重复测定5次;校准完成后，把用作标准的新鲜血连续测定10次，计算均值，并把此均值作为新鲜血的参考值;用新鲜血代替校准品对本室Abbott CD-1700（1）、CD-1700（2）和Act.diff（Beckman Coulter）三台血细胞分析仪进行校准;然后随机选取一个正常新鲜血抗凝全标本对四台血细胞分析仪进行质控，与患者标本一起测定;以Abbott CD-3200血细胞分析仪测定的5份新鲜血标本为参考，分别在其他三台分析仪上测定5次，取其均值，计算它们与被校准仪的偏差。
1.3 统计学方法 采用电脑程序化的样本配对t检验和线性回归统计学方法进行分析。
2 结果
用新鲜血代替校准品对本室Abbott CD-1700（1）、CD-1700（2）和Act.diff（Beckman Coulter）三台血细胞分析仪进行校准;随机选取一个正常新鲜血抗凝全标本对四台血细胞分析仪与患者标本一起测定，三台血细胞分析仪与Ab-bott CD-3200各参数之间的相关系数r>0.9。特别是WBC、RBC、HGB、HCT这四项参数的符合性最好，见表1。 以Abbott CD-3200血细胞分析仪测定的5份新鲜血标本为参考分别在其他三台分析仪上测定5次，计算它们与被校准仪器的偏差，结果表明:用配套校准品校准过Ab-bott CD-3200血液细胞分析仪与用新鲜血校准过的三台仪器测定5份新鲜血的结果非常接近，只有PLT和MPV的偏差比较大，但仍在可接受范围内，见表2。
表1 被校准三台血细胞分析仪相关性分析 （略）
表2 三台血细胞新鲜血测定结果与CD-3200测定值的偏差 （略）
3 讨论
血细胞分析仪由于计数结果准确，精密度高，操作简便、快速，因而发展迅速，已逐渐取代传统的手工法，并成为临床实验室的主要检测手段。由于生产血细胞仪的厂家较多，各自使用的测定原理和方法不尽相同，导致其测定结果及参考范围有所差异。另一方面，在国内的大中型医院，同一实验室使用不同厂家和型号的血细胞计数仪已成为较普遍现象，致使在同一实验室内同一标本用不同的仪器分析，出现测定值的差异，给评估和解释结果带来一定的困难，给疾病的诊断、治疗及预后带来误解和不良的影响 ［2］ 。在血液细胞分析仪质量控制过程中，仪器的校准是不可少的。所谓自动血液细胞分析仪实际上就是一台比较器，将它实测数据与校准数据进行比较，从而得出血标本的测定结果。由此可见，标准物在仪器测定结果是否准确的问题上有决定性的作用 ［3］ 。为保证血液细胞分析仪准确性，最好使用仪器生产厂家推荐的配套校准物对仪器进行校准，但由于校准物价格昂贵且有效期特别短，可只购买一台性能较好仪器的配套校准物 ［4］ 。 血细胞分析仪是精密测量仪器，对周围环境有较高的要求。温度、相对湿度、周围电磁场及室内空气中尘埃，都会干扰仪器进行血细胞计数时的电脉冲分析，特别是对血小板计数的干扰更为突出，是导致PLT、MPV偏差较大的原 因之一;我室由于情况特殊，除Abbott CD-3200血细胞分析仪在周围环境较好的住院部专门仪器房外，余三台血细胞分析仪均集中在条件较差的门诊。而且在EDTA?K 2 抗凝血中，血小板体积不稳定，随时间的延长而增大，这也是导致PLT、MPV偏差较大的主要原因。本研究结果表明:用新鲜血校准的三台血细胞分析仪与Abbott CD-3200各参数之间的相关系数r>0.90，特别是WBC、RBC、HGB、HCT这四项参数的符合性最好;说明用新鲜血校准血液细胞分析仪可取得满意结果。每天对同一实验室不同血细胞分析仪结果进行校准，是保证分析结果准确度和精密度的有效手段和措施。用配套校准物校准一台性能最佳的血细胞分析仪，再用新鲜血在这台仪器上得出参考值后去校准其他仪器，既可节省经费，又能保证实验结果的可靠性。
参考文献
1 彭明婷，申子瑜.血细胞分析溯源体系的建立及有关问题的探讨.中华检验医学杂志，2004，27（3）:132-133.
2 彭明婷，谷小林.不同方法校准血液分析仪结果比较.中华检验 医学杂志，2000，23（1）:35-37.
【关键词】31P NMR cos-7细胞 pH
1 引言
细胞内PH一直都是生物化学和生物学研究的重点，也是研究最基础的部分。正是细胞内外的PH离子梯度差，使离子在细胞内PH的影响下进行内外转换，从而产生离子通道，影响细胞的功能和代谢[1]。所以细胞内的PH和离子通道的分析研究，对一些生理的发展和病理改变起到重要的作用。为了研究游离离子Ca2+、Li+、Mg2+等及通道的变化，现在已经创建了许多新的生物分析方法。这些种分析方法具有连续动态、长时间、无损伤的优点。为观察细胞代谢，能量转换及病理生理变化等提供了新的研究方法。因为细胞内功能和代谢受细胞内PH的影响，所以部分酶的活性与其有着紧密的联系。细胞代谢及转化的生理学数据，是由细胞内PH决定的。过去测定细胞内PH的方法是弱碱弱酸分布法和Pt/H电极法，缺点是数值不准确，而且不能反复检测。当前广泛应用的是PH敏感性电极法，测得数值准确无误可靠性高，可做检测时必须将微电极插到细胞内测定数值，这样就破坏了完整的细胞膜，所以不能完全准确的测定在正常细胞膜完整的生理情况下细胞内PH的准确数值。在科学的不断发展创新中核磁共振的产生，给生理学和生物化学的研究指引了新的研究方向。人们所重视的问题一直是细胞内PH的测定。应用多的方法有NMR法测定pH，可以采取19F NMR方法和31P NMR方法。利用NMR检测得到的pH在条件适宜情况下其准确度可以达到0.06pH单位。对于干扰生物样品信号会使测定的误差增加。实验所建立的31P测定猴的肾细胞cos-7细胞株细胞内的pH的方法，可为cos-7细胞表达的基因转染提供可靠依据。
2 实验部分
2.1 试剂、细胞系及培养条件 小牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所（56℃，30min灭活，置于-20℃冰箱中待用）；细胞系及培养条件（duIbecco EagIe’s minimum essentiaI medium（DMEM）粉剂购自Gibco公司。
将猴的肾细胞cos-7细胞株接种在含有10%的胎牛血清中，100mg/L链霉素及100U/mL青霉素DMEM培养溶液中，在温度为37℃环境下，CO2含量在5%的空气及饱和湿度CO2培养箱中培养。 转贴于
2.2 实验方法
2.2.1 细胞的处理 在使用核磁共振测定之前，用台盼兰对细胞进行染色处理，与显微镜下计数活动度要在95%以上，用0.25%胰蛋白酶消化收集，在对数生长期的cos-7 细胞，温度在4℃环境下以1000r/min离心2min。用温度为4℃的0.9%的氯化钠溶液悬浮细胞，所用溶液的体积要等于细胞体积的两倍，用离心机离心去除胰蛋白酶中的含磷物质及培养基。重新用相当于细胞体积0.2倍的0.9%氯化钠溶液悬浮细胞，放入消毒处理后的2mm核磁管中，此时细胞在溶液中的浓度为3.4×108细胞/ml
2.2.2 31P NMR谱测试 JNM-ECA-400超导核磁共振仪（日本电子公司），工作频率为161.83MHZ，脉冲宽度12.4μs（30°），延迟时间为2s，数据采集点1k，累加次数4691，以亚甲基双磷酸MDP（0.05moI）作外标，化学位移（×10-6）为21.42，实验温度为室温[1]。
3 结果与讨论
3.1 PH值的测算 使用核磁共振检测方法既不破坏细胞的完整，又能检测很微小的细胞及细胞器内的PH，还可以连续动态的测定部分重要细胞做出反应时的PH，对其进行动态跟踪。通过上述实验绘制cos-7细胞31P NMR谱，绘制精准的曲线图，推算出cos-7细胞内的PH值计算公式为；PH=6.79+10g［(δ-1.54)/(7.12-δ)］，根据公式计算得出PH=5.58±0.04。
3.2 31P谱及pH测定条件分析 cos-7细胞是一种SV40病毒的猴的细菌株，它可以减退生长，它的自身蛋白表达很少，是运用较为广泛的真核表达的系统。常用于表达外援基因，成功测定cos-7细胞内的PH值能更好的观察PH是怎样对转染表达产生影响的。
上述实验证明，如想获得更好的NMR信号，应使细胞内的含磷总体数量达到一定的值，必须用活细胞制作成密度较高的细胞悬液达到（108细胞/ml以上）。然而密度较高的细胞悬液在时间很短的范围内会快速发生代谢变化。所以在做细胞处理时动作要快速，在温度为4℃的环境下离心，离心处理完成后要迅速进行值的测定。处理动作慢的情况下细胞的代谢加快，实验测定的谱图里会看见明显增高的无机磷峰值，则检测不到ATP等其它含有磷化合物的峰值。因ATP等含磷化合物会以能量的形式代谢转化为无机磷。
本研究利用31P核磁共振的方法对cos-7细胞内的PH值做测定和分析。达到了对细胞内游离离子及离子通道的核磁共振的分析。
