【关键词】中药鉴定学;线索式教学法;课堂教学
中药鉴定学研究的对象是中药，包括中药材、饮片及中成药，教材中共收录了300多种，具体中药品种涉及的内容包括来源、植物(动物)形态、产地、采收加工、化学成分、性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别、性味与功能等，而性状鉴别中又包括形状、大小、颜色、表面、质地、断面、气味等若干内容，有些中药还涉及混伪品的鉴别，故该课程具有品种多、内容繁杂而关联性少、涉及知识面广等特点，是较难学的专业课之一。该课程学习的难点不是理论深奥难以理解，而是难记忆［2－5］，这不仅是学生遇到的困难，也是新任课教师所必须解决的难题。线索式教学法是指在教学过程中有意识地创设并执行一条清晰的主线，并以这条主线为载体实现教学目标与教学内容的有机结合，使知识系统化［6］。该方法能通过恰当的线索将纷繁的知识点串联起来，形成系统的知识链，当可以从一个知识点联想到下一个知识点时，记忆量就减少了，记忆效率就会提高，这不仅能帮助教师在繁多的教学内容中找到头绪，使得授课过程思路清晰、逻辑性强，也可帮助学生理清知识脉络，提高学习效果。笔者尝试将线索式教学方法运用到课堂教学中，取得较好效果。现报告如下。
1线索的选择
线索的选择是线索式教学法的关键环节，好比蚕茧抽丝，只有找准了丝头，才能顺畅地抽出整根丝。恰当的线索应该是容易记忆的或是对学生能产生深刻印象的，同时能使人较容易地联想到下一个知识点，逐渐引导出尽可能多的知识点。常用的线索有以下几种类型。
1.1以药名作为线索
中药的命名方法丰富多彩，药名中蕴含着与之相关的信息，如功效、药性、产地、颜色、气味等，易于引导出下一个知识点，所以此类型线索是最常使用的。以细辛为例:细辛为常用中药，来源于马兜铃科植物，在教材各论中是第四个要介绍的中药，同时这味中药比较特殊，有小毒，又是“马兜铃酸事件”的主角之一，所以是重点讲授的中药品种之一，需要讲授的内容较多，包括来源植物、药用部位、产地、化学成分、性状特征、显微组织结构特征等。在教学过程中，采用线索式教学法，首先让学生联想其名字的含义，从名字中得到细辛“根细、气辛香、味辛辣麻舌”这三个重要的性状鉴别特征，再以此为线索，引导出“马兜铃酸事件”对细辛药用部位的影响及安全性控制、植物来源、其它性状鉴别特征、产地、显微结构特征、主要有效成分及毒性成分等，基本涵盖了所需讲授的内容，巧妙的通过名字为线索将零散的知识点串联在了一起(见图1)。
1.2以问题作为线索
选择作为线索的问题往往都是教学的重点内容，此类型线索能够引起学生的好奇、激发学生积极的思考，调动学生学习的主观能动性，同时该重点内容也能被学生牢记。以冬虫夏草为例:冬虫夏草为名贵中药，稀有、昂贵，市场上常有用其它虫草冒充冬虫夏草，所以在课堂讲授时，首先提出问题:虫草是否等同于冬虫夏草?以此为线索引出虫草形成的机理，虫草即真菌寄生在某种昆虫上的子座与昆虫尸体的复合体，使学生明白不同虫草的区别在于真菌与寄主昆虫的种类不同，于是解答了之前提出的问题，并自然地引导出冬虫夏草形成的机理，继而引出其性状鉴别特征及显微鉴别特征(见图2)。
1.3以基本概念作为线索
基本概念、基本理论是学好中药鉴定学这门课程的基础，以基本概念为线索符合学生的认知规律。以川贝母为例:川贝母是多基原品种，商品规格主要分为松贝、青贝、炉贝，市场上还有多种贝母类药材，如教材中所收录的浙贝母、平贝母、湖北贝母、伊贝母，如果每一种贝母都单独讲授，既耗时又不利于学生抓住重点，所以在授课时，以“鳞茎”这一基本概念作为线索，紧紧抓住贝母类药材的药用部位均为鳞茎这一共同点，通过讲解鳞茎的概念，归纳总结出贝母类药材的共性，包括组成、气味、主要有效成分及显微粉末特征，再引导出不同贝母类药材的个性特征，这样既避免了共性特征的重复讲授，又教会了学生如何区分不同贝母类药材(见图3)。
1.4以经验鉴别术语作为线索
经验鉴别术语具有形象生动、易懂易记的特点，包含着大量与该药相关的信息。以厚朴为例:厚朴为皮类中药中的重点品种之一，需要掌握的知识点较多。授课时，以品质较佳的厚朴习称“紫油厚朴”这一经验鉴别术语为线索，从“紫”引导出厚朴内表面颜色，继而引出加工干燥方式;从“油”引导出内表面刻划特征及主要有效成分挥发油，继而引出气香及显微特征中的油细胞特征;从“厚朴”在《说文解字》中的解释，即厚皮，引导出药用部位，继而引出商品规格，而皮类中药断面特征十分重要，由此引出断面性状鉴别特征，继而引出另一主要有效成分及主要显微粉末特征(见图4)。
2讨论
线索式教学法适用于知识点之间能建立关联，并能找到恰当的线索将知识点串联起来的中药品种，所以该方法只是中药鉴定学教学方法中的一种，“教学有法，教无定法”，要根据授课内容选择恰当的教学方法，甚至是多种方法的配合使用。此外，在应用线索式教学法时，讲授知识的先后顺序不同于教材编排的顺序，而且线索引导图中往往很难将所有知识点都串联进去，所以在教学中要及时告知学生所讲知识点在教材中的位置，使学生跟上教师的教学思路，做好笔记，同时补充线索引导图中未关联的内容，做好对授课内容的归纳总结。在《中药鉴定学》课堂教学中应用线索式教学法，关键是选择恰当的线索，画出线索引导图，这既是教学的思路图，可帮助教师理清教学脉络，使教学讲解清晰、流畅，也使得教学内容简明扼要、便于记忆。该方法既然可以帮助教师更好地记忆教学内容，也可作为学生学习《中药鉴定学》课程的一种方法。教师将该方法介绍给学生，同时指导并训练学生画线索引导图，既可以使学生理解教师的上课思路，更好地配合教师，也有助于学生找出并理解知识点间的联系，把握教学要点，提高记忆效率。教学过程就本质而言是教与学两个方面的活动，只有教、学双方共同配合，线索式教学法才能达到满意的教学效果。
参考文献
［1］卫莹芳．中药鉴定学［M］．上海:上海科学技术出版社，2010．
［2］吴启南．《中药鉴定学》的教学方法浅析［J］．中医药学刊，2003，21(8):1348．
［3］田景明，王晓琴，鄢长华．中药鉴定学教学方法探讨［J］．内蒙古医科大学学报(教育版)，2014，36(S2):794－796．
［4］刘义梅，陈科力．中药鉴定学教学方法探讨［J］．中国中医药现代远程教育，2014，12(4):91－93．
［5］杨竹雅，张洁，吴梅，等．中药鉴定学理论课程教学模式初探［J］．中国民族民间医药，2015，24(21):156，158．
关键词：中药材鉴定；微性状特征；安卓；互联网技术
中图分类号：TP311 文献标识码：A 文章编号：1009-3044（2016）36-0178-03
1 概述
目前我国中药材市场假冒伪劣药材屡禁不止，严重危害人民群众身体健康和中医药的发展。因此对中药材进行准确、快速鉴定已成为一个急待解决的难题，其重要性和意义越来越显得突出。目前国内外各种学者专家对假冒伪劣中药材的鉴定方法主要有理化法[1-3]、显微法[4，5]、近红外光谱法[6，7]、电子鼻和电子舌法[8-10]，微性状鉴别法[11-13]等。微性状鉴别法利用光学显微镜对药材表面细微的性状特征进行微观观察，虽然相对来说成本最低[11]，但微性状鉴定核心步骤都需要有丰富经验的鉴定人员参与，如微性状照片的景深合成、真伪性状的识别和对比等，其鉴定结果严重依赖于某个鉴定人员素质。且以上各种鉴定方法受成本、方法、技术以及人员素质的等影响，不能为社会基层组织和老百姓提供廉价、快速、准确的鉴定服务。因此，本课题提出一种基于中药材微性状方法的自动识别系统。
2 中药材微性状真伪自动识别系统
首先筛选易混的70种中药材，并采集他们的微性状图片，经过图像预处理，微性状特征提取，在服务器数据库中建立中药材微性状图谱特征库；然后通过设计android手机客户端和后台服务器图像识别程序，利用手机显微镜配合手机客户端拍照并上传中药材微性状图像到后台服务器图像识别程序中对比中药材微性状图谱特征库，通过数据交换进行自动识别；最后将识别的结果发送反馈给手机客户端，显示识别结果。
系统包括中药材微性状图谱特征库，android手机客户端以及后台服务器图像识别程序三方面内容。主要设计思路如图1 所示。
通过互联网技术，我们实现了不同设备间的数据交换与传递，对于不同的人来说，只要他有一台可以连入互联网的设备，并拥有一台简单的显微镜，便能够对易混中药材的真伪鉴定。
2.1 中药材微性状图谱特征库的建立
首先对《中华人民共和国药典》（2010 版一部及附录）中的药材进行分析比较，选择伪品较多的、难以鉴别的 70 种药材为研究对象，在显微镜下进行拍摄，利用Photoshop软件进行景深合成，采集他们的微性状图片；然后利用Matlab软件进行图像预处理，即使用线性滤波去除景深合成所带来的噪声，再将去噪后的图像转变到HSV空间中去[14]；接着对于中药材微性状的三种特征即颜色特征，纹理特征和几何形状特征分别利用颜色矩[15]，灰度共生矩阵[16]以及Hu不变矩[17]来提取；最后利用SVM[18]分类器进行训练。
需要注意的是，并不意味着一种中药材的特征提取就只用一种方法，对复杂的伪品往往会采用三种类型联合的方式进行特征提取，以提高识别的准确性。经过图像采集、图像的预处理、图像的特征提取后，即可把70种常见易混伪中药材的特征参数及其图像信息存入数据库中，构建易混伪中药材微性状图谱特征库。
2.2中药材真伪自动识别系统安卓手机客户端的编写
中药材真伪自动识别手机客户端，采用谷歌开发的android SDK6.0版本，利用谷歌推出的android studio集成环境编写。手机客户端主要包含三个功能部分，中药材微性状图片的选取，中药材微性状图片的上传以及识别结果的显示。
1）中药材微性状图片的选取
手机客户端支持利用手机自带后置摄像头结合手机显微镜来拍z采集中药材的微性状图片上传到后台服务器图像识别程序中，也可以将保存在手机相册中的数码相机结合显微镜拍摄的中药材的微性状图片进行上传，参见图2。为了使手机拍摄和相册中选取的照片保持像素尺寸的一致，便于后台服务器图像识别程序的处理，我们在手机客户端中设计了图像裁剪功能，并设定了默认裁剪比例。经过这部处理，我们将要上传的中药材微性状图片的像素尺寸都被统一的设定为8*8共64个像素点，这为了是去除图片的细节，只保留结构、明暗等基本信息，摒弃不同尺寸、比例带来的图片差异。实现方法如下：
int width = 8；
int height = 8；
BufferedImage source = ImageHelper.readPNGImage（filename）；
BufferedImage thumb = ImageHelper.thumb（source， width， height， false）；
2）中药材微性状图片的上传
经过上一步的图像选取及裁剪，我们得到手机客户端采集并初步处理过的中药材微性状图片。我们利用HTTP协议中的POST方法，结合异步处理过程，将图片发送到后台服务器图像识别程序中，图像主要方法如下：
RequestParams params = new RequestParams（）；
try {
params.put（"img"， imageFile）；
} catch（FileNotFoundException e）
{e.printStackTrace（）；}
getHttpClient（）.post（mRequestSearchImageUrl，params，handler）；
通过异步上传图片的方法，可以在上传过程中，释放占用的线程等资源，等到结果产生再重新获取线程处理，提高响应效率，避免了大量数据上传造成的线程阻塞。
3）中药材微性状图片识别结果的显示
被上传到后台服务器图像识别程序中的图片，将被预处理，特征提取以及对比中药材微性状图谱特征库中类似的图片进行核心算法自动识别。识别完后，将结果返回给手机客户端。详细内容将在1.3中描述。
2.3中药材真伪自动识别系统后台服务器图像识别程序的编写
后台服务器处理程序，是整个系统的核心部件。它采用java语言，利用IBM的Eclipse集成编程环境编写。它不仅跟手机客户端进行请求应答，还通过与Matlab的LibSVM API接口程序，将上传的图像交给Matlab软件处理。Matlab处理过程包括图像的，去噪声，HSV空间转换，三种特征提取以及利用SVM分类器实现图像的自动识别，前三个过程前文已提到，此处不在描写，此处对于LibSVM API最核心核心的方法进行描述：
svm.svm_train（svm_problem，svm_parameter）；
svm.svm_load_model（文件名）；
svm.svm_save_model（文件名，svm_model）；
svm.svm_predict_values（svm_model，svm_node，double）；
后台服务器处理程序在收到Matlab LibSVM API接口程序返回的结果后，根据返回结果查询中药材微性状图谱特征库中保存的中药材图片信息并将查询结果封装在json字符转中，利用RequestContext这一对象中的print方法，将最终的识别结果回传给手机客户端。核心代码如下所示：
public void identificationList（RequestContext ctx） throws IOException{
int pageno = ctx.param（"page"， 1）；
System.out.println（"page->>"+pageno）；
pageno = pageno
try{
List ids = Identification.INSTANCE.IDs（homeIds）；
int size = ids.size（）；
int beginIndex = （pageno - 1） * 10；
int toIndex = pageno * 10；
List returnIds = ids.subList（（beginIndex > size ？ size ： beginIndex）， （toIndex > size ？ size ： toIndex））；
List list = Identification.INSTANCE.LoadList（returnIds）；
System.out.println（"list->>"+list）；
Gson gson = new Gson（）；
String jsonList = gson.toJson（list.toArray（））；
System.out.println（jsonList）；
ctx.print（jsonList）；
}finally{
DBManager.closeConnection（）；
}}
最K手机客户收到后台服务器图像识别程序回传的json字符串，利用JSON-lib包，将json解析成String类型字符串，并最终通过ListViewMedicinePhotoAdapter这一android手机列表图像适配器，显示到手机客户端中。
我们以伪品菟丝子为例，利用手机显微镜及手机客户端在光照强度为1200 lux的实验室中，拍摄了100张伪品菟丝子的微性状图片，并上传到后台服务器自动识别程序中，在等待11秒后，手机客户端收到识别鉴定的结果如图3所示。
鉴定结果显示
3 结束语
本文创新之处在于，利用互联网结束使微性状的鉴定更加智能化、自动化，从而使中药材鉴别操作更加简化、测量更准确，还降低了中药材鉴定的成本，能够实现中药材快速、无损鉴别，是一种不要求使用者有某些专业技能，真正面向基层的“傻瓜式”自动识别系统。
本文所设计的自动识别系统，还有改进之处。例如，中药材微性状特征库的种类不够丰富，目前只能对少数中药材进行自动识别，识别速度及准确率有待进一步提升等等。下一步我们需要扩大特征库的数量，涵盖更多种类的中药材，优化算法，选更合适的分类器，提升识别的速度与准确率，更简单、廉价、快速地为广大基层中医药工作者提供鉴定服务。
参考文献：
[1] 李德强，段立广，郑旭光，等.对照提取物定性和单标定量相结合的白芷药材质量控制研究[J].中国临床药理学杂志，2016，32（4）：333-336.
[2]邓德洪，胡菊.狼毒药材HPLC指纹图谱研究[J].国际检验医学杂志，2016，37（4）：447-451.
[3] 昱桦.猴耳环化学成分的分离与鉴定[J].天津药学，2015，27（6）：5-8.
[4] 刘文，严华，董亚娟，等.广防风基原与鉴别[J]药物分析杂志，2015，35（2）：370-374.
[5]房楠，吴玟萱，明全忠，等.苗药金铁锁质量标准完善研究，药物分析杂志，2015，35（2）：344-349.
[6]耿姝，陈勇，金叶，等.基于近红外技术的金银花药材多指标成分快速检测 [J].2016，33（2）：144-149.
[7]李化，苏建春，柯华香，等.基于近红外漫反射光谱和多元数据分析的黄芩质量标准的快速评价方法研究[J].2015，35（3）：518-523.
[8] 黎量，杨诗龙，胥敏，等.基于电子鼻电子舌技术的山楂气、味鉴别[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（5）：99-102.[9]LiS，LiX R，Wang G L.Rapid discrimination of Chinese red ginseng and Korean ginseng using an electronic nose coupled with chemometrics[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2012，（70）：605-608.
[10]周霞，杨诗龙，胥敏，等.电子舌技术鉴别黄连及其炮制品[J].中成药，2015，37（9）：1993-1997.
[11]曹海燕，周建理，杨青山.葶苈子及其混伪品的微性状鉴别[J].上海中医药大学学报，2012，（4）：98-99.
[12]王雪丽，周建理，杨青山.紫苏子及其混伪品的微性状对比鉴别[J].上海中医药大学学报，2013，（1）：78-80.
[13]张帆，赵鑫磊，张伟，等.微性状鉴别法鉴别中药红花及其掺伪品[J].安徽中医药大学学报，2015，34（3）：90-92.
[14] 郭英华. 基于 HSV 色彩空间的图像分割[J]. 黑龙江冶金， 2011 （2）： 35-37.
[15] Stricker M A， Orengo M. Similarity of color images[C]//IS&T/SPIE's Symposium on Electronic Imaging： Science & Technology. International Society for Optics and Photonics， 1995： 381-392.
[16] R. M. Harlick， K. Shanmugam， I. H. Dinstein.Texture features for image classification[J]. IEEE Transactions on Systems， Man and Cybernetics，1973，3（6）：610-621.
[关键词] 中药鉴定；发展史；方法学；研究方向
中药鉴定学是研究和鉴定中药的品种和质量，制定中药质量标准，寻找和扩大新药源的应用学科[1-2]。其研究对象是中药，包括中药材、饮片和中成药。在中药现代化的进程中，中药的真伪优劣鉴定具有非常重要的作用，因此中药鉴定学的发展是其他中医药学科发展的基础和保障，是中药领域的基础学科，已成为广大中药学专业学生的一门必修课[3]。
1中药鉴定学科及其方法学的产生
中药鉴定学是在古代本草学和现代生药学的基础上形成并发展起来的。20世纪30年代，国外生药学传入我国，1934年赵橘黄与徐伯鋆合编了《现代本草学——生药学》上册，1937年叶三多编写了《生药学》下册，这是两本把近代生药学理论和方法介绍到本草学和中药学研究的专著和教材[4-6]。
1949年以后，我国生药学进入迅速发展时期。楼之岑教授和徐国钧教授是我国现代生药学的主要奠基者，他们对现代生药学方法进行了系统的介绍，把四大鉴定方法引入了中药鉴定，并应用于大量中药鉴定研究实践，对中药鉴定学科的建设做出了开拓性贡献。20世纪50年代以后，出版了一系列以中药鉴定为主要内容的学术著作，如《中国药典》（1953年版、1963年版第1部）、李承祜（1952年）、楼之岑（1955年、1964年）、徐国钧（1957年）等多版生药学教材，19551965年裴鉴、周太炎编著了《中国药用植物志》共8册，中国医学科学院药物研究所等编著了《中药志》（19591961年），谢宗万编著了《中药材品种论述》（1964年），以及《药材学》（1960）、《中药鉴别手册》（1959）、《中药材手册》、《药材资料汇编》、《中药鉴定参考资料》、《中草药学》、《中药大辞典》等一系列著作。这些著作和工作，从不同侧面对中药的四大鉴别（基原鉴别、性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别）作了详细的论述，为中药鉴定学的确立打下了坚实的基础[1-6]。这些著作的出版标志着我国中药鉴定研究发展的第一个高潮[2-6]。
1956年我国组建了北京、上海、广州、成都等4所中医学院，以后相继建立20多所中医院校，中医药教育从此不断扩大和提高。1959年，各学校相继成立了中药系，开设中药专业，1964年开设了《中药材鉴定学》课程，并被确立为专业课之一[2，7]。1977年，成都中医学院主编了我国第一本高等院校《中药鉴定学》教材，明确了中药鉴定学“是研究和鉴定中药的品种和质量，寻找和扩大新药源的学科”，确定了四大鉴别方法，其主要内容记叙方式为以后的版本所采用，为中药鉴定学教材的更新打下了基础，是中药鉴定学史上的一个重要里程碑，标志中药鉴定学科的形成。此后，随着中药鉴定研究的发展、中药标准化的进程和《中国药典》的不断改进，《中药鉴定学》教材也不断发行各种新版本对内容进行充实和更新，如成都中医药大学的第2版（1979年）、任仁安的第3版（1986年）、李家实的第4版（1996年）和康廷国的第5版教材（2003年，2007年），以及张贵君（2002年）、石俊英（2006年）和王喜军（2012年）等各种版本的《中药鉴定学》教材，这些各具特色和多样性的教材极大繁荣和丰富了中药鉴定学的学科建设内容，促进了其发展。2002年张贵君主编的版本中明确提出了制定中药质量标准是中药鉴定学的任务之一[2]，自此，中药鉴定学就包括继承祖国药学遗产、整理中药品种，制定中药标准，鉴定中药的品种和质量，寻找和扩大新药源这四大任务。
在中药鉴定学的发展过程中，植物系统分类学、植物化学、生物化学、分子生物学、细胞生物学及现代仪器分析等多学科的知识和技术，相互融合应用于中药的品质和资源研究[3]，衍生和发展了一些新的学科，如中药资源学、中药分子鉴定学、中药（材）商品学、中成药分析、药用植物学、药用动物学、药用矿物学等，形成了中药鉴定学蓬勃发展的学科群。其中中药资源学不仅涉及到中药资源品种的鉴定、生态、分布、保护、生产和开发利用，还涉及到资源活性成分的生物转化和生物工程等工程学科，因此，中药鉴定学与中药资源学存在很多交叉内容。21世纪初开始，现代生物技术，现代仪器分析技术和计算机技术大量应用于中药鉴定研究，生物鉴定方法不断发展和完善，标志中药鉴定学已经进入了生命科学和信息科学时代，开启了中药鉴定学新的发展阶段。
2中药鉴定方法学的发展进程
2.1来源鉴定和品种整理
用系统分类学方法确定中药的原植物或原动物的来源物种是一切中药鉴定方法的基础。古代本草和文献中所载的药物来源是当代用药的依据之一。对古今中药品种进行考证并探讨其历史演变，实地对药材原植物进行分类鉴定、结合现代临床应用和药理药化研究进行品种整理是中药鉴定研究的一个基本方法。
六五（1981—1985年）期间，“中药材同名异物的系统研究”对贝母类、金银花、大黄、柴胡、细辛、石斛等类中药材的同名异物混乱品种进行了系统研究，在地理分布、生态、植物形态、生药性状、商品规格、显微鉴定、理化分析等方面比较了其异同，从而达到了正确鉴定品种，制定品质标准的目的，为逐步澄清中药材同名异物的品种，发展生产提供了依据[8]。七五（1986—1990年）和八五（1991—1995年）期间，楼之岑和徐国鈞院士牵头开展了对213类中药材进行了“品种整理与质量评价”的系统研究，这是新中国成立以来中药研究的一次系统的大总结。该项目对多来源中药进行本草考证、生药鉴定、化学成分、药理作用等10项系统研究，对澄清混乱品种，提高鉴定技术水平，保证药材质量，保障用药安全有效，修订、制定药品标准，开发利用新药源均有重要的科学意义和实用价值[7-8]。建国以来经过本草考证的中药材品种已有200多种，大部分常用中草药进行了系统整理研究。90年代以后，《新华本草纲要》1～3册（1988—1991年）、《中华本草》30卷（1999年）和4个民族卷（2002—2005年）、《新编中药志》1～4册（2002年）等大型中药学著作陆续出版，全面总结了我国当代中药研究包括中药鉴定和品种整理研究的最新成果，标志着我国中药鉴定研究达到了一个新的高度[7-8]。
在中药品种整理的基础上，中药资源的近缘种及系统分类研究也得到快速发展，如“九五”以来，北京中医药大学杨春澍等完成了“八角茴香类和地枫皮类药的系统研究”，中国科学院西北高原生物研究所何廷农等完成了“中国龙胆科植物的研究”[3]。2005年，肖培根院士依据植物的分类学、系统学、植物化学、药理学等多学科方法建立了研究亲缘关系、化学成分和疗效间的相关性的药用植物亲缘学。并用于大黄类、贝母类、芍药类、苍术类等药材亲缘关系的研究，对于正确进行系统分类，发现中药新资源具有重要意义[9]。通过品种整理和基原鉴定确定了中药材的来源物种，出版了大量专著和中药材原植物原色图谱，其中国家药典委员会组织，陈士林、林余霖等主编的2010年版《中华人民共和国药典中药材及原植物彩色图鉴》是中药材原植物鉴定重要的参考书。
分子生物学的一些最新成果和大量数据不断冲击传统的被子植物分类系统，为一些有争议类群的划分提供了新的证据。国际上的一些学者（angiosperm phylogeny group，APG组），联合起来制订了结合分子分类依据的被子植物分类系统，于1998，2003，2009年分别推出了第1，2，3版《被子植物APG分类法》。该系统吸收了当前全世界大部分著名的植物分类学家的意见，并在不断修改中[10]。APG分类系统的意义，在于依据植物界内在的分子信息系统进行系统分类。分子生物学和植物分类学的发展变化为中药的来源鉴定提供了新的思路和方法。
2.2性状鉴定
性状鉴定是用感官观查中药性状特征的方法，是中药材和中药饮片鉴别最常用的手段。自1953年始，《中国药典》收载了药材的性状标准，为中药性状鉴定提供了法定依据。20世纪50年代后，中药性状鉴定融入了中药经验鉴别的方法，将现代生物形态学、分类学理论知识与传统药材的经验鉴别相结合，把药材性状特征归纳为形状、大小、表面、颜色、质地、断面、气、味、水试、火试10个方面，确立了中药性状系统鉴定的基本方法[1-6]。自20世纪50年代以来，我国学者出版了大量重要的含有中药性状鉴定内容的著作，如《药材学》、《中药材手册》、《药材资料汇编》、《现代中药材商品通鉴》等，并详细地记载了药材的产销及商品规格等方面的知识； 还出版了大量的药材及饮片的彩色图谱，如中国药品生物制品鉴定所等编著的《中国中药材真伪鉴别图典》（1～4册），是药材性状图文鉴定的重要工具书之一，阎文玫的《实用中药饮片鉴别图谱》（2005）、郭长强等的《中药饮片炮制彩色图谱》（2011）和陈士林、林余霖主编的《中药饮片标准图鉴》（2013）是大型的饮片图谱参考书。这些高质量的彩色图谱，为中药材和饮片进行外观质量鉴定提供了直观的参考依据。
中药的性状鉴定技术结合现代数码、信息和计算技术，发展了一些新方法[11-14]：①中药形态结构计算机三维重建与实时动态显示技术，将模式识别的原理和模式分类方法引入多目标识别过程，实现了中药形态组织三维动态显示及其形态学参数测定。肖小河等以中药附子为例进行了连续切片的三维重建与动态显示，提供了中药鉴定生动和立体的三维图像和技术资料[11-12]。②中药微形态系统鉴定法，利用体视显微镜或加上数码成像技术，依据药材表面的细微特征信息实现中药材鉴别的方法。胡东维[15]等对十字花科19种植物种子依据种皮微形态特征的鉴别是一个成功的范例。周建理等[16]利用体视显微镜等结合电脑软件，研究了根据药材表面的信息特征实现中药材鉴别的方法。③中药脉序图谱鉴别法，依据不同种类植物之间在叶形、叶脉、脉序等形态等方面的信息来鉴别中药与其易混品的方法[17-18]。④仿生识别法，即结合仿生生物技术和计算机技术，对气味、味道和颜色进行智能识别的方法。嗅觉仿生（电子鼻）和味觉仿生（电子舌）[12-14]技术已经成功地应用在中药鉴别的探索中。应用现代先进的智能识别技术发展较为客观的性状鉴别方法，将是中药鉴定有意义的一项研究探索；微形态等方法能使现有的性状鉴定信息更为丰富和精细，是较为简单、实用和直观的方法，这项工作的系统化、数据化和信息化将有利于推广应用。
2.3显微鉴定
显微鉴定是用显微镜观察中药组织结构和粉末特征的方法，仍然是中药鉴定研究的重要内容。建国后中国才真正开始药材粉末的显微鉴别研究。1951年南京药学院徐国钧院士发表了101种药材粉末鉴定的检索表，开中药粉末鉴定之先河；此后，他陆续对400余种中药进行了显微鉴别研究，并将其技术运用到中成药的鉴别中。1986年，徐国钧主编的《中药材粉末显微鉴定》出版，使我国粉末生药显微鉴定达到国际先进水平，填补了我国中药粉末系统研究的空白[19]。七五和八五期间，213类中药材进行了品种整理与质量评价研究，显微鉴别是其中的重要内容之一。1977年版《中国药典》开始收载显微鉴别内容，用于中药材、中成药的鉴别，改变了“膏丹丸散、神仙难辨”的局面。此后不断增加，2010年版《中国药典》显微鉴别内容达到总共1 253项，较2005版增加了633项，所有药材、饮片和含生药粉的中成药都增加了专属性很强的显微鉴别内容[20-21]。
数码摄影技术的发展和偏光显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、扫描电子显微镜等多种光学仪器的应用，使显微鉴定技术与电子技术结合，能够对中药材、饮片和含生药粉末的中药丸、散等进行多元素、多角度的分析，为中药显微鉴定提供新的依据[11-13，22]。透射显微镜能观察到亚显微和细胞器结构，如从罂粟果的乳汁细胞里能看到充满生物碱的囊泡[14]，这一应用还有待深入研究。扫描电镜由于能清楚地辨别细胞表面的精微纹饰和附属物，已被广泛地应用于花粉粒和种子表面超微特征的观察进行物种鉴别，如康廷国等利用扫描电镜对4 种洋金花的花粉粒进行观察， 发现它们的超微特征有显著区别[11，23]；还被用于茎、叶表面或动物药表面特异性信息特征的分析，如张朝晖等发现海龙类药材表面微皮纹有明显的种间差异[24]。偏光和荧光显微镜能增加显微结构和显微特征的鉴别信息。赵中振等[25]对偏光镜下中药材粉末特征的特异性信息进行了深入的研究，并主要利用偏光镜通过药材的偏光特征鉴别了含34种药材的至宝三鞭丸，这对含有生药粉的中成药的鉴别有特殊意义。Liang等[26]使用荧光显微技术，利用茎的横切面形状、内皮层细胞壁荧光特征等鉴别点，区分了白花蛇舌草与其2种密切联系的同属易混品。Chu等[27]使用普通光学显微镜与荧光显微镜，通过观察表面片、横切片腺毛、非腺毛等显微特征及横切面的不同荧光特征，能区别金银花和山银花5 种忍冬属植物的花蕾。数码摄影技术使药材的显微结构和粉末显微特征图谱逐渐告别手绘图形，出版了《中华人民共和国药典中药材显微鉴别彩色图鉴》等大量彩色数码显微特征图谱的专著。
显微镜技术还结合多种技术发展了调查活性成分在不同组织间分布的组织化学定位法。如谭玲玲等[28]用香草醛-冰醋酸和高氯酸混合试剂显色，用显微镜观察发现北柴胡的柴胡皂苷主要分布在中柱鞘和次生韧皮部中。鄢丹等[29]采用红细胞凝集试验法和化学特征谱法测定板蓝根的抗病毒活性，发现断面木皮比低于1∶1的板蓝根质量较优。蔡宗苇等[30]建立了一种利用质谱仪直接分析植物组织切片化学成分的方法，为组织化学定位提供了一种无需样品化学处理的直接分析方法。
2.4理化鉴定
理化鉴定是用物理和化学方法，对中药所含有效或特征性成分进行定性、定量分析，以鉴定真伪优劣的方法。20世纪50年代，色谱、光谱技术等在中药分析的应用中得到推广，使中药理化鉴定的系统方法逐渐形成并趋于完善。
色谱技术在20世纪初产生，于60年代开始用于中药分析，经逐步完善后列入1977年版药典，且在以后各版药典的中药和成方制剂中的应用比例迅速上升，并成为中药鉴别的核心技术之一。其中薄层色谱法最早应用于中药的理化鉴定，采用对照品、对照药材或对照提取物进行对照鉴定，促使TLC成为中药定性鉴定中专属性较强和最广泛使用的色谱技术。中药薄层色谱研究的代表性著作是谢培山等编著的《中华人民共和国药典中药材薄层色谱彩色图集》（2009）等。随着色谱分离、分析技术的发展，高效液相色谱法（HPLC）为代表的色谱技术逐渐成为中药鉴定的主要技术，其他包括气相色谱法（GC）、高效毛细管电泳法（HPCE）和凝胶电泳等方法，可更精细和准确地反映中药中的化学组分和数量分布等特征，成为中药鉴定和质量控制的最有效方法之一[11]。2010年版药典含量测定从2005年版的245项增加到720项，其中稳定性和精确度较高的高效液相色谱法含量测定新增412项达到总共587项，对中药标准化起着极大的促进作用，此外新增了离子色谱法用于离子化合物的测定[20-21]。采用HPLC分离技术，能够得到标示某种中药特征的共有峰指纹图谱，从而实现对中药有效组分的质量控制。现阶段，HPLC是中药注射剂应用指纹图谱实现质量控制的主要方法。现已普遍采用HPLC，TLC，GC，HPCE等技术对植物药有效组分进行多成分质量控制研究，其中用一个标准品对多指标成分进行分析的方法，由于简便、实用、成本低，是首先推荐发展的方法。孙国祥等[31-32]利用数学原理将检测信号转化成易于判别、能揭示潜在化学成分和生物活性特征的数字化信息，建立了中药色谱指纹图谱潜信息特征判据方法和定性、定量相似度评价体系，对深化指纹图谱研究具有启示作用。
紫外、荧光、中红外、近红外、拉曼光谱及等离子体光谱（ICP）等光谱技术被大量成功应用到中药材和中药饮片的鉴定研究中[11]，其中有些研究具有系统性，如孙素琴等[33]测试了 200 多种对照药材的红外光谱，姜大成等[34]对16组54种动物药材的红外光谱进行了鉴别研究；李峰等[35]用荧光光谱对16种矿物药进行了鉴别。在这些光谱方法中，现代近红外和拉曼光谱技术由于分析速度快、样品可无需处理或对样品无损，正在发展成一种中药快检和在线监测技术。X衍射技术首次于1997年运用于中药材的鉴定，相比植物和动物类药材的鉴定，在矿物类中药的鉴定效果较好，对于大量矿物类中药能准确鉴定，如张志杰等对我国雄黄药材的成分和晶型用X衍射技术进行了确定[36]。2010年版药典新增了ICP光谱法用于中药中有害金属元素的测定[20-21]。
色谱-光谱联用技术将具高效分离性能的色谱技术与能获取化学成分丰富结构信息的光谱技术相结合形成的新技术，是新技术的迅速发展和中药理化鉴定方法不断创新的结果。高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）、气相色谱-质谱（GC-MS）、红外光谱-质谱（IR-MS）、质谱-质谱（MS-MS）、气相色谱-付里叶变换红外光谱（GC-FTIR）、高效毛细管电泳-质谱（HPCE-MS）等在中药的品种鉴定与质量评价方面发挥了重大的作用。其中应用最广泛的是液质（HPLC-MS）联用技术。2010年版《中国药典》首次采用液谱-质联用技术（HPLC-MS）控制中药材千里光中的有毒成分和测定川楝子、苦楝皮中既有效又有毒的成分[20，21]。
2.5生物鉴定
生物鉴定即对生物特征的鉴定，是对中药所含化学物质的生物效应（药效、活力或毒力）测定或对生命信息物质（核酸、蛋白质、细胞结构等）的识别，以达到品质鉴定目的的一种方法[37]。常用的方法有免疫鉴定法、生物效价或生物活性测定法、DNA分子鉴定法、mRNA差异显示鉴定法、细胞生物学鉴定法等[37-39]。生物鉴定作为中药鉴定学的一种方法学始见于张贵君主编的2009年版的教材[2]。
2.5.1生物效价测定法 对活性物质不明确的中药，生物效价或活性测定是评价质量常用的方法。常用的有抗菌效价、免疫作用、抗凝血活性、异常毒性、降压物质的测定以及过敏反应检查法、溶血与凝聚检查法等[37-39]。在2010年版药典中，用抗凝血酶活性来评价水蛭药材的有效性；在地黄的鉴别中，采用薄层自显影技术，既达到薄层色谱分离的显色效果，又可同时检测供试品抗氧化的强度[20-21]。肖小河等依据中药药性理论和热力学理论，提出基于生物热动力表达的中药质量生物效价评价方法[11]。不同中药作用于微生物生长代谢的热功率谱图和热动力学参数可作为中药生物检测的定量指标。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等细菌为观察对象，研究了不同种质的板蓝根[40]、不同产地的黄连[41]对菌株的不同生物热力学表达影响，表明该方法可用于鉴定不同品种、不同产地、不同生长年限的药材。
2.5.2免疫鉴定法 不同动植物药材含有不同的特异蛋白，免疫鉴别即用动植物所含的特异蛋白制备的特异抗体与待检品中的特异抗原结合产生沉淀反应来鉴别药材的真伪。该技术适用于亲缘关系比较接近的动物药的鉴别。丁培贤等[42]采用免疫电泳法及琼脂免疫扩散法准确鉴定了虎、豹等多种动物的骨骼，并能将豹骨进一步鉴定为雪豹、云豹或金钱豹。这说明免疫鉴定方法是一种特异性很强的鉴别法。
2.5.3中药分子鉴定法 中药分子鉴定一般是指依据大分子（核酸和蛋白）特征的鉴定。由于中药样品的特殊性，核酸分子鉴定主要集中于DNA分子鉴定，如DNA条形码鉴定技术、基于PCR的分子鉴定技术、基于分子杂交的DNA分子技术等。20世纪90年代，随着生物技术的发展，中药鉴定学与分子生物学相融合，形成了分子生药学这一新兴交叉学科[3]。1992—2003年，有60多类型植物药、12个类型的动物药用分子生物学方法进行了鉴别研究，发表了百余篇论文。2000年，黄璐琦等编著了《分子生药学》[39]（2000年第1版，2006年第2版），该书系统总结和论述了分子生药学的理论和方法。2004年邵鹏柱、曹晖等编著了《中药分子鉴定》一书，着重介绍10余种常用和基本的分子生物学方法及其在中药分子鉴定中的应用，是国内外分子鉴定研究成果的汇总和总结[43]。中药分子鉴定技术不仅用于中药不同物种的鉴别，也广泛用于种下不同居群、不同种质资源和地道药材的研究[39]，已用于厚朴、芍药、苍术、白芷、栝楼、明党参、半夏等诸多药材的种内及种间关系研究，为中药鉴定提供了遗传学证据。2010年版《中国药典》首次采用了DNA分子鉴定技术用于川贝母及蛇类药材物种的鉴定[20]。2010年，陈士林等完成了常用中药材原植物DNA条形码的鉴定研究，编著了《中药DNA条形码分子鉴定》[44]，通过研究比较psbA-trnH， matK， rbcL， rpoC1， ycf5， ITS2和ITS等7个候选DNA条形码，发现ITS2是最佳条形码序列。随着中药材 DNA 条形码分子鉴定方法研究的深入与普及，国家药典委员会讨论通过中药材DNA 条形码分子鉴定指导原则列入2010年版《中国药典》增补本[45]。
3中药鉴定方法学的发展趋势
早期中药鉴定方法包括来源、性状、显微和理化鉴定四大鉴别法。随着生物技术的发展和安全性评价的需要，又逐渐发展和完善了生物鉴定法。这些方法都在不断发展中，在保证临床用药安全有效方面都有着不可替代的重要作用，对推动中药鉴定学的发展有非常重要的意义。
中药的特点是品种多，其形态和组织千变万化，其化学成分或有效成分复杂。品种多，就需要系统、大规模地比较和分析其鉴别特征，才能准确地把握和鉴别它们。当代学科发展的最大特点是计算科学技术、网络技术和信息技术的渗透，使得中药的系统鉴别特征和方法能够信息化、数据化，便于传播。中药鉴定技术的信息化和系统化发展，有利于它的推广和应用。随着物理、化学、生物学和信息科学的发展，以及仪器分析的手段不断更新，紫外、红外、质谱、核磁共振、气相、高效液相、各种电泳分析法、扫描电子显微镜技术、分子生物学技术、X射线衍射技术、计算机数据和图像处理技术、智能技术等多种技术的组合被吸收运用到中药鉴定方法中，将不断用客观、科学的分析方法，完善和代替主观的分析方法，用准确、精细的分析方法代替粗略笼统的分析方法，不断丰富中药鉴定学的内容，形成以“四大鉴别法”为基础、以生物技术结合理化分析为重点、逐步适应中药现代化并有利于中药走向世界的一套更为科学、完善、先进的中药鉴定体系。各种通用化、标准化、精细化的中药鉴定技术的系统化和信息化发展成为未来中药鉴定方法学发展的方向。
系统生物基因组学、蛋白质组学和代谢组学等多种现代生物技术整体研究方法，有助于帮助人们逐步形成从局部观走向整体观，从线性思维走向复杂性思维，正确认识中药质量。因此，基于系统生物学整体研究的思路和方法建立中药品质整体综合分析模式和生物鉴定方法，将是中药品质评价发展的一项重要研究内容。
中医药历史源远流长。在当前我国大力加强中药研究和加速中药现代化的进程中，中药的准确鉴别仍然是确保中药科研结果可靠，确保中药质量的必不可少的工作。中药鉴定工作者将在继承有价值的传统鉴别技术的基础上，不断研究和发展实用的中药现代鉴别技术，使中药鉴定的内容和方法更为丰富、完善，并不断推广和市场化，以满足中药事业发展的需要。
[参考文献]
[1] 康廷国. 中药鉴定学[M].北京：中国中医药出版社，2007.
[2] 张贵君. 中药鉴定学[M]. 北京：科学出版社，2002.
[3] “九五”以来中药学科发展报告（1996—2007年），第一部分中药学科中药鉴定学[R].2008.
[4] 徐国钧.生药学[M]. 北京：人民卫生出版社，1987.
[5] 黄璐琦，张瑞贤，曹春雨. 我国生药学的历史回顾[J]. 中国中药杂志，2000，25（4）：195.
[6] 邬家林. 中药鉴定学的历史沿革（摘要）[J]. 中药材科技，1984（2）：32.
[7] 田丽娟. 中国现代药学史研究[D]. 沈阳： 沈阳药科大学，2006.
[8] 蔡少青，王璇. 常用中药材品种整理与质量研究·北方编.第6册[M]. 北京：北京医科大学出版社，2001.
[9] 陈四保，彭勇，陈士林，等. 药用植物亲缘学[J]. 世界科学技术——中医药现代化，2005，7（6）：97.
[10] The Angiosperm Phylogeny Group. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants： APG III[J]. Bot J Linn Soc，2009，161（2）：105.
[11] 陈士林，郭宝林，张贵君，等. 中药鉴定学新技术新方法研究进展[J].中国中药杂志，2012，37（8）：1043.
[12] 黄璐琦，胡之璧.中药鉴定新技术新方法及其应用[M].北京：人民卫生出版社，2010.
[13] 龙芳，李会军，李萍. 新技术和新方法在中药性状与显微鉴别中的应用[J].中国中药杂志，2012，37（8）：1076.
[14] 李薇，肖翔林，龚奥娣，等. 近年来中药鉴定技术发展的特点[J]. 中药材，2003，26（3）：222.
[15] 胡东维，蒋选利，姚雅琴，等. 十字花科十九种种皮微形态学研究[J].西北农业大学学报，1992，22（ 1）：61.
[16] 周建理，杨青山. 中药微性状鉴定法[J]. 安徽中医学院学报，2001，30（1）：66.
[17] 陈泽濂，吴七根. 双子叶植物的叶脉特征在植物分类学上的应用[J].植物学通报，1993，10（增刊）：35.
[18] 何报作，曾静，韦郃，等. 鬼针草与易淆品白花鬼针草的叶形态——脉序图谱鉴别特征[J]. 中国中药杂志，2009，34（20）：2559.
[19] 徐珞珊. 科学人物药学篇——徐国钧[EB/OL]. 2004-06-04. http：// bioon. com/popular/scientist/200406/40860. html.
[20] 中国药典.一部[S].2010.
[21] 蒲旭峰.《中华人民共和国药典》2010 年版一部增修订概况[J].中药与临床，2010，1（4）：10.
[22] 刘萌萌，李峰. 显微鉴定新技术在中药材鉴定中的应用进展[J].辽宁中医药大学学报，2011，13（12）：50.
[23] 康廷国，纪俊远，王金萍，等. 四种洋金花的显微鉴定[J].中药通报，1987，12（12）：12.
[24] 张朝晖，濮祖茂，徐珞珊，等.海龙类药材扫描电镜观察[J].中药材，1997，20（12）：604.
[25] Zhao Z Z， Shimomura H， Sashida Y， et al. Identification of traditional Chinese patent medicines by a polariscope（1）-（3）[J]. Nat Med，1996，50（6）：389.
[26] Liang Z T，Jiang Z H，Leung K S，et al. Distinguishing the medicinal herb Oldenlandia diffusa from similar species of the same genus using fluorescence microscopy[J].Microsc Res Tech，2006，69（4）：277.
[27] Chu C，Liu H J，Qi L W，et al. Combination of normal light and fluorescence microscopy for authentication of five Lonicera species flower buds[J]. Microsc Res Tech，2011，74（ 2）：133.
[28] 谭玲玲，胡正海，蔡霞，等.北柴胡营养器官中主要化学成分的组织化学定位及其含量比较[J]. 分子细胞生物学报，2007，40（4）：214.
[29] 鄢丹，韩玉梅，骆骄阳，等.板蓝根木皮比与药效及化学成分的相关性分析[J]. 中药材，2011，34（1）：43.
[30] 蔡宗苇.直接分析植物组织切片化学成分的方法：中国，200610164872.7[P].2008-06-11.
[31] 孙国祥，胡玥珊，张春玲，等. 构建中药数字化指纹图谱研究[J]. 药物分析杂志，2009， 29（1）：160.
[32] 孙国祥，侯志飞， 毕雨萌，等.中药色谱指纹图谱潜信息特征判据研究[J].药学学报，2006，41（9）：857.
[33] 孙素琴，张宣，秦竹，等. FTIR 直接鉴别植物生药材[J]. 光谱学与光谱分析，1999，19： 542.
[34] 姜大成，张洁，邓明鲁.16组54种动物药材的红外光谱鉴别研究[J]. 中草药，1999，30（2）：75.
[35] 李峰，岳金波，李久明.16种矿物药的荧光光谱鉴别[J]. 中药材，1998，21（12）：609.
[36] 张志杰，周群，尉京志，等. 我国药用雄黄的晶体结构鉴定[J]. 光谱学与光谱分析，2011，31（2）：291.
[37] 王晶娟，张贵君. 中药生物鉴定法的内涵与教学模式[J]. 药学教育，2010，26（4）：22.
[38] 张贵君，李晓波，李仁伟. 常用中药生物鉴定[M]. 北京：化学工业出版社， 2006.
[39] 黄璐琦. 分子生药学[M].北京：北京大学医学出版社，2006.
[40] 赵艳玲， 山丽梅， 金城， 等. 基于生物热活性表达的中药板蓝根品质评价研究[J]. 中药材， 2008， 31（5）： 743.
[41] 代春美， 肖小河， 胡艳军， 等. 微量热法对不同产地黄连品质的评价[J]. 中成药， 2008， 30（8）：1179.
[42] 丁培贤，贺天笙.生物免疫化学法检定虎、豹骨的研究[J]. 中国药学杂志， 1989， 24（8）：457.
[43] 肖培根. 中药分子鉴定评介[J]. 中国中药杂志，2005，30（19）：1559.
[44] 陈士林. 中药DNA条形码分子鉴定[M].北京：人民卫生出版社， 2012.
[45] 陈士林， 姚辉， 韩建萍， 等. 中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则[J]. 中国中药杂志， 2013， 38（2）： 141.
Development history of methodology of Chinese Medicines′ Authentication
CHEN Ke-li1*， HUANG Lin-fang2， LIU Yi-mei1
（1.Development of Pharmacy， Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan 430065， China；
2.Institute of Medicinal Plant Development.Chinese Academy of Medical Sciences &
Peking Union Medical College， Beijing 100193， China）
[Abtract] This paper reviewed the emergence process of the subject and methodology of Chinese Medicines′ Authentication. Based on the research progress and major achievements acquired in research of each methodology including identification of origin， description， microscopic， physical， chemical and biological characteristics of Chinese medicines， it is expounded that the development process of each methodology combined modern digital technology， information science and its own characteristics. And the development direction is further described for methodology of Chinese Medicines′ Authentication towards systematization and informationization.
【关键词】 白族药；紫金龙；特征图谱；HPLC
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）04-0001-03
Abstract：Objective To establish the HPLC fingerprint of Dactylicapnos scandentis radix and to research the quality of Dactylicapnos scandentis radix.Methods The gradient elution and multiple wavelength mode was applied in chromatographic separation，and chromatographic fingerprint similarity evaluation software（2012A） was used to analyse data.Results 10 peaks were identified as the characteristic fingerprints of Dactylicapnos scandentis radix. All samples tested contained the same 10 peaks， but the content of each peak showed great difference among the samples，which resulted in the differences on their chromatograms.Conclusion This method is simple，accurate with good reproducibility，and can be used for the quality control of Dactylicapnos scandentis radix.
Keywords：Traditional Bai Medicine；Dactylicapnos Scandentis Radix；Fingerprint；HPLC
白族药滋坚伦（白语：Zixjieilht）为罂粟科植物紫金龙Dactylicapnos scandens （D.Don） Hutch.的根，别名串枝莲、碗豆七，夏秋采集其根，晒干后入药。其味苦、性凉，有毒，具有消炎、止痛镇痛、止血、降压的功效，白族民间用于胃痛、神经性头痛、牙痛、外伤肿痛、外伤出血、高血压等。在我国西南地区民间广泛用于牙痛、神经性头痛、胃痛和止血，临床表明具有较好的镇痛作用[1-5]。紫金龙含有多种生物碱，主含普罗托品、异紫堇定等[6-8]。中药材指纹图谱是近年来被国际公认的控制中药或天然药物质量的有效方法，其优点在于较全面反映中药复杂的化学成分及其相对比例。研究采用反相高效液相色谱法建立紫金龙药材的特征指纹图谱，为该药材的质量评价提供依据[9]。
1 仪器与材料
1.1 仪器 安捷伦1200高效液相色谱仪（包括自动进样器、DAD紫外检测器、HP 色谱工作站等）；GWA-UN2-C30纯水器；CQ-250超声波清洗仪；岛津AND GH-252电子天平。
1.2 材料 紫金龙药材经大理州食品药品检验所杨怀镜主任药师鉴定为罂粟科植物紫金龙Dactylicapnos scandens（D.Don）Hutch.的干燥根，所测样品见表1；原阿片碱（批号：110853-200402，中国药品生物制品检定所）；近视乐眼药水（市场抽样合格制剂）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱为Inertsil ODS-SP（4.6mm×150mm，5μm）；流动相A相为0.2%磷酸水溶液（三乙胺调pH为7.0），B相为甲醇，梯度洗脱，见表2；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；检测波长：0～40min波长为230nm，40～90min切换至285nm；进样量：紫金龙（1～12）进样10μl，原阿片碱对照品进样5μl，近视乐眼药水参照物溶液进样5μl。
2.2 对照品溶液制备 精密称取原阿片碱对照品5.46mg置10ml量瓶，加甲醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤后作为对照品溶液，进样5μl，见图1；取近视乐眼药水2ml用水稀释至50ml的容量瓶中，摇匀，微孔滤膜过滤后作为参照物溶液进样5μl，记录色谱图，见图2。
2.3 供试品溶液制备 精密称取60℃干燥至恒重的紫金龙粉末2g（过40目筛），置具塞锥形瓶中，加入氨水将其润湿，放置30min，加甲醇和氯仿（1∶1）混合溶液20ml，超声提取30min，放冷后，滤过，蒸干，残渣用甲醇分次溶解，转移至10ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤后进样10μl，记录色谱图，见图3。
2.4 特征图谱评价方法 采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版（2012A）。对照图谱生成方法为中位数法，时间窗宽度为0.5min，相似度计算方法为夹角余弦法。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度实验 取同一供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱，比较各色谱峰的保留时间，结果表明6次进样各共有峰相对保留时间RSD在0.14%～0.38% 之间，相似度在0.990～1 之间，符合指纹图谱研究技术的要求。
[JP+1]2.5.2 重复性实验 取同一批紫金龙药材6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别检测指纹图谱，结果表明各共有峰保留时间RSD在0.12%～0.45%之间，相似度在0.992～0.999之间，符合指纹图谱研究技术的要求。
2.5.3 稳定性实验 取同一批供试品溶液，分别于0、2、4、 8、12、24h 检测指纹图谱，结果表明各特征峰无明显差异，各色谱峰共有峰保留时间RSD在0.15%～0.44%之间，相似度在0.999～1，表明样品溶液在24h内稳定。
2.6 结果
2.6.1 图谱测定时间的确定 取样品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，记录120min内色谱图，结果表明，90min 后无特征峰出现，故确定图谱记录时间为90min。
2.6.2 空白实验 取甲醇溶液5μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，空白无干扰。
2.6.3 样品特征图谱测定 取表1中的样品，按“2.3”项下方法获得供试溶液，进样10μl，记录HPLC色谱图，结果见图4。
2.6.4 共有峰的确定及相似度计算 根据12批紫金龙药材特征图谱的检测结果，按“2.4”项下方法，以紫金龙对照药材S12为参照图谱，全谱峰匹配，生成紫金龙药材对照特征图谱（见图4 R） ，其中共匹配出10个峰（见图3），构成紫金龙药材的特征共有峰。通过与对照品图谱比对，指认4号峰为原阿片碱峰，6号峰为近视乐眼药水参照物峰。因原阿片碱峰面积适中且峰形稳定故以其为参照峰，利用该软件对12 批特征图谱进行数据处理，各共有峰相对保留时间RSD在0.15%～0.44% 之间，各批次相似度值高，结果见表3 所示。可以看出，12批紫金龙药材特征图谱的相似度均>0.9，说明不同来源的紫金龙药材具有较高的均一性。
2.6.5 样品特征图谱分析 由于标准品有限，实验未对其他特征峰进行指认与分析。本实验测试样品包括了不同产地、不同类型（栽培、野生及商品药材）的紫金龙，其HPLC特征图谱均具有上述特征峰，相互间吻合较好，可作为紫金龙的特征指纹。
3 讨论
3.1 提取方法的选择 实验以尽可能多体现紫金龙主要成分为原则，设计样品溶液制备方法。分别选取体积分数为70%乙醇、甲醇、氯仿为提取溶媒，对提取物HPLC图谱分析，但效果都不理想。可能是由于紫金龙中生物碱在极性和含量上差异较大，很难用单一的溶媒取得满意的效果。考虑碱性条件易于生物碱的溶出，所得峰较多，故比较氨水润湿时间的长短对实验结果的影响。结果表明，氨水润湿30min后制备的供试品中峰形最佳。实验还考察了超声20、30、40、50min提取效果，结果提示，超声提取30min及以上，所得各峰响应值较高且无明显差异。所以实验采用加氨水润湿30min后，加20ml甲醇和氯仿（1∶1）混合溶液，超声提取30min，作为供试液制备方法[10-12]。
3.2 流动相的选择 实验考察了多种流动相：甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液（三乙胺调pH至7.0）、甲醇-0.005mol/L磷酸氢二钠溶液（三乙胺调节pH值至9.0）。结果表明，甲醇-0.2%磷酸水溶液（三乙胺调pH至7.0）系统中色谱峰多且峰形较好，所以选择该流动相系统。
实验中考察了Phenomenex Synergi Polar-RP 80A（250mm×4.6mm，4μm）、CAPCELL PAK C18（150mm×4.6mm，5μm）、Inertsil ODS-SP（4.6mm×150mm，5μm）三根不同厂家的色谱柱，结果表明采用Inertsil ODS-SP（4.6mm×150mm，5μm）色谱柱所得图谱基线平稳，色谱峰数目较多，分离度，峰形好，因此选用该柱进行特征图谱研究。
3.3 检测波长及柱温的选择 实验从200～400nm内挑选了210、230、245、275、285、320、340、370nm 波长显示色谱图，并记录全谱段三维图谱。结果在低波长色谱段基线不平，检测波长为230nm时，在40min后色谱峰较为稀疏且特征峰6过高，此时将检测波长切换为285nm，得到峰数较多，同时解决了特征峰6过高问题，最后结合三维图谱，选择用波长切换的方法对其进行分析，即0～40min检测波长为230nm，40～90min检测波长为285nm，使色谱峰尽可能得到体现。
实验比较了四个不同柱温下的色谱图（25、30、35、40℃），发现随柱温上升，各色谱峰变化不明显，故选择35℃为指纹图谱的检测柱温。
3.4 特征图谱相似度评价 实验采用了HPLC 对紫金龙进行分析，各样品HPLC 特征图谱虽存在一定差异，但均具有相同的色谱特征峰，所建立的特征图谱具有稳定性和可控性。不同来源的紫金龙药材分析结果可以看出，各色谱峰的保留时间匹配好，特征峰含量分布差异较大，以全谱峰匹配方式计算相似度，各批次差异较大，但在选定的色谱条件下以两个已知特征峰：特征峰4（原阿片碱）、特征峰6作为多点校正，Mark峰匹配方式计算相似度，则各批次相似度高，表明紫金龙药材色谱图征峰4、特征峰6含量稳定，其余特征峰含量个体差异较大。
参考文献
[1]南京中医药大学.中药大辞典（下册）[M].上海：上海科学技术出版社，2006：3291.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].1977：586.
[3]大理州白族自治州人民政府.大理中药资源志[M].昆明：云南民族出版社，1991：83.
[4]钱信忠.有毒中草药大辞典[M].天津.天津科技翻译出版公司，1992：561.
[5]张文鑫，韩丽妹，周毅生，等.RP-HPLC同时测定紫金龙中四种异喹啉生物碱的含量[J].中国药学杂志 2009，44（3）：233-236.
[6]吴颖瑞，赵友兴，刘玉清，等.紫金龙的生物碱成分研究[J].天然产物研究与开发，2008，20： 622-626.
[7]钱金螅周粤.白族草药紫金龙成分的研究[J].西北药学杂志，2000，15（2）：57-58.
[8]罗建蓉，钱金螅周浓.紫金龙脂溶性化学成分的研究[J].西北药学杂志，2010，25（1）：19-20.
[9]周玉新.中药指纹图谱研究技术[M].北京：化学工业出版社，2002.
[10]宋双红，王粗，张媛，等.黄芩药材HPLC 指纹图谱的研究[J].中国药学杂志，2006，41（6）：413-417.
[11]简伟杰，段琼，段天璇，等.灯心草药材RP-HPLC指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：60-63.
【摘要】 目的建立3种石斛药材的氢核磁共振谱（1HNMR）特征图谱。方法首先采用溶剂萃取法或硅胶色谱分离法获得3种石斛（束花石斛D.chrysanthum Wall.，铁皮石斛D. candidum Wall.ex Lindl和金钗石斛D.nobile Lindl.）的特征提取物及其主要成分，然后利用FT-1HNMR（300MHz）技术测定得1HNMR特征图谱并对特征信号进行归属。结果束花石斛、金钗石斛的SCE-B和铁皮石斛的SCEA特征提取物的1HNMR特征图谱可作为该药材基源鉴定的相对标准图谱。结论 建立的1HNMR特征图谱方法在鉴别中药石斛上具有指导意义。
【关键词】 束花石斛 铁皮石斛 金钗石斛 氢核磁共振谱特征图谱
Abstract：ObjectiveTo analyse the 1HNMR fingerprints of 3 Dendrobium species.MethodsSolvent extraction and silica gel chromatography were used to separate the chemical constituents of SCE A or B from the stem of 3 Dendrobium species. The characteristic signals of the 1HNMR finger print were ananlysed after determining the structures of the compounds isolated from SCE A or B. Results1HNMR characteristic spectrum of the samples of D. chrysanthum Wall.， D. candidum Wall.ex Lindl and D.nobile Lindl. collected from different regions showed highly characteristic features and reproducibility， respectively. ConclusionThe 1HNMR spectrum of SCE A or B from the stem of 3 Dendrobium species can be utilized for its original authentication.
Key words：Dendrobium chrysanthum; D. candidum; D. nobile; 1HNMR characteristic spectra
石斛为常用中药，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳的功效。《中国药典》2000年版收载石斛原植物包括环草石斛Dendrobium loddigesii Rolfe，马鞭石斛D. fimbriafum Hook.var.oculatum Hook.，黄草（束花）石斛D. chrysanthum Wall.，铁皮石斛D. candidum Wall.ex Lindl.及金钗石斛D. nobile Lindl.的新鲜或干燥茎。市场上商品石斛原植物（约有30种）来源非常复杂［1，2］，虽对石斛属植物的生药学研究已有很多报道［3，4］，但是，由于某些植物的形态学和组织学特征具有较大的相似性，使得鉴定评价工作仍比较困难。
国内外学者曾提出用核磁共振波谱法鉴定中药材之真伪［5～8］。其方法学研究的基础来自植物成分特征性和重现性的考察。石斛1HNMR图谱的特征性是指其区别于其他品种的特征信号的组成，其实质是各品种中药所含特征性化学成分或其组成方式不同。石斛属植物中主要含有石斛碱型、四氢吡咯型生物碱、picrotoxane倍半萜、联苄类、菲类等特征性成分［9］。本研究室的前期研究工作已经完成了环草石斛的特征提取物1H-NMR图谱的制定和解析工作。根据化合物的酸碱性、极性大小设定一定的提取物获取程序，对于含有生物碱类化合物的药材主要考察其总生物碱的核磁共振氢谱指纹图谱。本实验是在此基础上，进行3种石斛药材1H-NMR特征图谱的制定及解析工作。
1 仪器与材料
HNMR谱用Burker ACF-300型NMR波谱仪测定，TMS为内标，溶剂采用Cambridge Isotope Laboratories Inc的氘代核磁试剂CDCl3及DMSO-d6。1HNMR谱等的测定温度（探头温度）室温25℃，脉冲宽度8 μs，脉冲延迟时间为6 s，自旋速度20 Hz。扫描次数64。实验所用各石斛属植物样品系采自各产地，经徐珞珊教授鉴定学名，自然干燥，粉碎。见表1。表1 束花、金钗、铁皮石斛的样品（略）
2 方法
2.1 1HNMR指纹图谱的测定取各生药样品30 g，加95%的EtOH回流提取，按流程［9］获取各样品SCE-A和B ，并测定其1HNMR指纹图谱。
2.2 重现性考察中药1HNMR图谱的重现性包含两方面意义，即同基源同来源样品的重现性和同基源不同来源样品的重现性。
2.2.1 同基源同来源样品的重现性考察按照特征提取物获取程序［9］，得到特征提取物SCE-A，B，溶解于CDCl3或DMSO-d6，测定3种石斛药材的1HNMR（300 MHz）图谱，考察NMR仪器参数对同一样品测定结果的影响和特征提取物获取程序的重现性。结果表明其同基源同来源样品具有很好的重现性。
2.2.2 同基源不同来源样品的重现性考察测定不同采收地3种石斛特征提取物SCE-A、B的1HNMR特征图谱。研究结果表明，①铁皮石斛SCE-A的1HNMR图谱具有很好的重现性；②金钗石斛、束花石斛的特征提取物（总碱SCE-B）的1HNMR图谱具有很好的重现性；而SCE-A的1HNMR图谱的重现性较差。不同来源样品的SCE-A的图谱差异较大。
3 结果与讨论
3.1 束花石斛由于指纹图谱中的信号是多个化合物信号的叠加，不能逐个予以辨认，但是通过与单体化合物的1HNMR图谱数据相对比可进行大致归属。在对化学成分研究的基础上［10，11］对束花石斛的1HNMR特征图谱的信号进行解析并归属（表2）。由于所含束花石斛生物碱cis-dendrochrysine， trans-dendrochrysine的光谱数据较特殊，在图1中可见d 4.52(m); 6.71(d); 7.68(d); 7.52(m，2H); 7.33(m，2H)这些trans-dendrochrysine的2; 2′; 3′; 2″， 6″和3″， 5″位氢的特征峰信号及d 4.42(m); 6.02 (d); 6.64(d); 7.40(m， 2H); 7.30(m， 2H) 处cis-dendrochrysine中2; 2′; 3′; 2″， 6″和3″， 5″位氢的特征共振信号。表2 不同来源束花石斛SCE-B的1HNMR特征图谱（略）
3.2 金钗石斛金钗石斛SCE-B的化学成分研究（《中国药科大学硕士学位论文》）表明其1HNMR特征图谱主要显示石斛碱dendrobine的特征共振信号(图2)，由于该化合物的含量较高，其特征信号在指纹图谱中可得到明确的归属：4.84(dd， J=5.5，3.0Hz)， 3.19(t，J=8.5Hz)， 2.71(t， J=7.0Hz.)， 2.53(s)， 2.46(dd， J=4.3， 5.7Hz)， 1.41(s)， 0.98(d， J=2.9Hz)分别于石斛碱的3位，2位质子，11亚甲基质子，N甲基，5次甲基质子，1位甲基，13和14位2个甲基的1HNMR数据完全一致。不同来源的金钗石斛SCE-B 1HNMR特征图谱信号（CDCL3，300 MHz）见表3。表3 不同来源金钗石斛SCE-B的1HNMR特征图谱数据（略）
3.3 铁皮石斛在铁皮石斛的特征提取物SCE A中分离得到4个化合物，确定化合物为moniliflormin(1)， moscatilin(2)， 3，4-dihydroxy-4'， 5-dimethoxy-bibenzyl (3)和顺式阿魏酸二十八烷基酯(4)，铁皮石斛的1HNMR特征图谱主要表现为联苄类化合物的共振信号，表现为上述化合物1，2，3，4的特征共振信号。具体指认如表4，其中δ 0.88， 1.25， 1.68， 表4 不同来源铁皮石斛SCE A的1HNMR特征图谱（略）
4.2处的共振氢信号为顺式阿魏酸二十八烷基酯的特征共振信号; δ2.8处为联苄类化合物α，α′位特征共振信号; δ3.8， 3.7， 3.6处为联苄类化合物甲氧基的特征共振信号， δ6.8处为3，4-dihydroxy-4′，5-dimethoxy-bibenzyl中苯环上3′，5′位质子的特征共振信号。
1HNMR法在定性鉴别中具有专属性强、快速、准确、灵敏度高等优点，在鉴别植物中药方面的应用上已有报道，但目前应用不多。由于植物中药的组分复杂，其1HNMR指纹图谱的制订和解析均有一定难度。本文探讨了利用1HNMR指纹图谱的方法鉴别中药石斛，在利用NMR法鉴别植物中药上是一个有意义的探索。
所制订的束花、金钗石斛的生物碱提取部位的1HNMR指纹图谱具有很强的特征性，能够准确地反映其特征性生物碱成分的存在和结构，可作为束花、金钗石斛药材基源鉴定的相对标准图谱；铁皮石斛SCE A的1HNMR指纹图谱有很好的重现性，能够作为其基源鉴定的相对标准图谱。
【参考文献】
［1］吉占和.中国石斛属的初步研究［J］.植物分类学报，1980，18(4):427.
［2］张 亮，马国祥，张正行，等.中药石斛质量的化学模式识别［J］.药学学报，1994，29(4):290.
［3］徐珞珊，徐国钧，沙文兰，等.中药石斛显微鉴定研究［J］.南京药学院学报，1980，(2):1.
［4］ 徐珞珊，徐国钧，林惠蓉，等.中药石斛显微鉴定研究Ⅱ［J］.南京药学院学报，1981，2:52.
［5］Rafael Suau， Ana Cuevas， Ana Isabel Garcia. et al.Isoquinoline Alkaloids from Platycapnos［J］.Phytochemistry， 1991，30(10):3315.
［6］秦海林，赵天增.核磁共振氢谱鉴别植物中药的研究［J］.药学学报，1999，34(1)：58.
［7］秦海林，赵天增，袁卫梅，等.虎杖、何首乌和掌叶大黄、唐古特大黄的1HNMR指纹图谱解析［J］.药学学报， 1999， 34(11)：828.
［8］秦海林，张建新，王峥涛，等.环草石斛的1HNMR指纹图谱解析［J］.中国中药杂志，2002，27（12）921.
［9］陈晓梅，郭顺星. 石斛属植物化学成分和药理作用的研究进展［J］.天然产物研究与开发，2001，13(1):70.
【关键词】直观性教学;实验教学;实地教学
doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.05.265文章编号:1006-1959(2010)-05-1269-02
生药学(Rharmacognosy)是一门研究生药的科学。它是应用本草学、植物学、动物学、化学、药理学和中医学等学科知识与现代科学技术研究生药(中药材)的名称、来源、生产、采收加工、化学成分、品质评价、分析鉴定、资源开发、药效药理、毒性与临床用途的综合应用学科[1]。是药学专业的专业课,实践性、操作性很强。
我校的药学专业(三年制)是2005年经国家教育部门批准设立的,2006年秋季开始招生,目前在校生有300余人。生药学于第四学期开设。由于药学专业在我校是一个新型专业,各种教学设备和实验材料严重不足,在一个时期内只能教授理论知识,导致了学生对生药只知其名,不识其物,实践能力差,犹如"纸上谈兵",不能满足以后工作的需要,没有一点学习兴趣。针对这种情况,在不断的教学实践中,我渐渐的摸索出了一些比较理想的教学方法,写下来和各位同仁探讨。
1.课堂教学
由于生药学这门课实践性很强,课堂教学必须要有直观性[2]。所谓直观性是指在教学过程中向学生提供鲜明、生动地感知材料,使知识以直观的形式呈现在学生面前,使他们看得见、听得到、摸得着[3]。通过直观性教学,激发学生的学习兴趣。
1.1 课堂教学中讲理论、看标本。教学中,先将生药的来源、采收加工、产地、化学成分、药理作用、功效、再重点讲授性状特征、显微鉴定、理化鉴别。课前,到药店购买一些比较便宜的常见的中药饮片,供学生边学理论边看实物,同时结合饮片特点和理论将重点难点编成歌诀,便于记忆学习。以党参为例:其性状特征描写为:"表面黄棕色至灰棕色,根头部有多数疣状凸起的茎痕及芽,习称:'狮子盘头';每个茎痕的顶端呈凹下的圆点状;根头下有致密的环状横纹,断面较平坦,有裂隙或放射状纹理……"[4],编成歌诀为:"党参长条圆柱形,狮子片头顶端生;上部多有环纹在,断面淡黄放射状"[5]。这样,提高了学生的积极性,不但掌握了生药的性状,而且认识了生药。
1.2 多媒体课堂教学。由于我校的特殊情况,对于平凉没有的或一些贵重的中药材,把所讲内容制作成幻灯片或其他多媒体形式,其中穿插大量、丰富、反映特征明显的图片,这些图片可以利用数码相机把书上所涉及的一些显微部分、解剖部分等找适当的材料拍摄下来用于课堂教学,使课堂内容更加真实、生动,也更具说服力。譬如在讲解性状特征、显微特征的时候,将真实的生药饮片、显微组织用照片演示出来,能够使学生更好的理解和掌握,实验课的开展也更加方便。另外,制作图片辑(如校园植物图片辑或者药用植物图片辑等)在课前、课间播放给学生欣赏,学生在欣赏的同时也认识了它们,课余就会主动留意身边的植物,这样可以拉近学生与这门课程的关系,对于该门课程的教学有很大的帮助。我们讲授的生药学内容是死的,多媒体能使死的东西变活,使枯燥乏味的东西变的生动、灵活,书本中的植物特征--红花、绿叶随着鼠标的点动轻轻飞来,本在显微镜下才能看到的细微特征,现在也清晰可见,因而极大的提高了学生的学习兴趣,由以往的被动接受知识变为主动投入其中。同学们说:《生药学》这种新颖的教学方式,为我们创造了优良的学习环境,让人在心情愉悦、爽快的氛围中更好的投入学习,我们上课时思想更加集中。在生药学中,"同名异物","同物异名"的现象很严重,形成了许多混淆品、伪品,在利用过程中造成了不便,甚至危机生命。以大黄为例说明:在我国,大黄属植物有27种2变种变型,作为药用的只有蓼科的唐古特大黄、掌叶大黄、药用大黄三种。而藏边大黄、河套大黄、华北大黄、天山大黄在民间都称大黄,导致误用。这个时候,就可以利用多媒体将其各自的性状特征及图片展现出来,重点讲授各自的异同,增强学生辨别真伪的能力。
2.实验教学
生药学是一门实验性很强的课程,包括组织切片的观察、粉末观察、理化鉴定、显微鉴定等内容,都是鉴别生药真伪的基本方法,是学生必须掌握的内容。我校的实验条件非常有限,没有切片机,没有横(纵)切面组织切片,这一部分就不能开展。为了弥补不足,在粉末鉴定和理化鉴定方面加强实验力度,培养学生自己动手的能力,制作粉末水装片、水合氯醛装片,在试验中,要求学生认真实验,不懂得随时讲授,当堂完成实验报告,及时指正,使学生探索知识的兴趣大大的增加。
3.走出课堂,实地教学
为了解决实验材料不足的现象,我在课间带领学生走出课堂,在田间地头、校园、山上、药店、市场等地方指导学生观察生药的特征,近距离体验,开阔视野,不但认识了药物,应用了理论,也陶冶了学生的情操。
经过一段时间的教学时间,这种教学方法比较适合我校的基本情况。老师教的轻松,学生学的有趣,也解决了实验材料的不足。同时培养了学生独立思考、独立学习的能力和方法。据调查,在所有的药学专业课中,生药学是学生最感兴趣最愿意学习的课程。
参考文献
[1] 罗集鹏.生药学[M]北京:中国医药科技出版社,1996.2.
[2] 陈川惠.中药鉴定学实践教学初探[J].卫生职业教育,2008,7:91.
[3] 沈思义.教学方法新编[M].北京:中国商业出版社,1991.5.
摘要：介绍了各种多元统计分析方法的基本原理及其在中药质量评价中的应用进展。
关键词：中药；质量评价；多元统计分析
我国中药材资源丰富，种类繁多，来源复杂，品种混乱，同物异名，同名异物现象多见。商品市场上除正品外，尚有代用品、伪品和混淆品，来源不同的药材，质量差异很大，势必影响临床的疗效，所以对中药质量的评价尤为重要。过去基本上是以传统的性状鉴定和显微鉴定确定真伪，以理化鉴定评价优劣。近年来发展起来一种新的技术――模式识别，它是根据物质所含的化学成分，利用TLC、UV、IR、HPLC、GC、MS等方法获得其化学数据，然后利用数学思想和方法对该类数据进行特征提取，对药材进行分析、决策和判断。此种方法迅速发展，逐渐取代了传统的中药材鉴定法。模式识别所用的方法较多，但最常用的为统计学方法，它是以数学上决策理论为基础，建立统计学识别模型，找出规律性认识。
1 多元统计分析方法在中药质量评价中的应用
11 聚类分析（Clustering analysis，简称CA）在中药质量评价中的应用
聚类分析法是数值分类学的新的分支，它是对一组尚无明确分类的样本，根据它们所表现的变量特征，按相似程度的大小加以归类，其目标是在模式空间中找到客观存在的类别。按聚类目的不同，可将聚类分析法分为R型聚类法和Q型聚类法。
其原理为：对任一含m个指标的样本，可定义为m维空间的点，在m维空间中的任意两点其相似性可用“距离”度量，定义为“dij”，若将任一样本看作一类，其类间相似性可用欧氏距离DE表示： DE=dij=［∑m
i=1(xil-xjl)2］1/2，式中：l=1，2，… m，表示样本的指标数；i，j表示样本序号；xil，xjl表示样本各指标。系统聚类法即对n个样本计算出两两间的距离dij，并从中找出距离最小的两类Gp与Gq，合并成一个新类Gr，重新计算新类与其他各类间的距离，再将距离最小的两类合并，重复以上过程至所有样本聚为一类为止。定义类Gk与Gr的距离Drk有以下递推公式:D2rk =αpD2pk+αqD2qk+βD2pq+γ|D2pk-D2qk|，式中参数αp，αq，β，γ取值不同对应不同的系统聚类方法。
该法除常用于中药系列品种的分类外，还可以广泛的引用于真伪鉴别、成分浅析、质量评价、新旧工艺或不同炮制方法比较、寻找代用品及扩大药用新资源等方面［1~7］，使中药研究跨进现代电脑量化分析的新阶段。
马英丽等［8］用甲醇回流提取黄芪中的皂苷类成分，以氯仿甲醇水（65：30：10）为展开剂，采用双波长薄层扫描法，在λs=390nm，λr=590nm下，对18个产地的黄芪样品进行了定量分析，以黄芪甲苷为指标成分，选用中位数法进行聚类，用余弦法计算样品间的相似性程度。结果系统聚类分析将样品分为3类，大多数产地的黄芪被聚为1类或2类，即质量较好或一般。表明，蒙古黄芪和膜荚黄芪被列为优质品，该结果与《中华人民共和国药典》2000年版将蒙古黄芪和膜荚黄芪列入正品相一致。王继国等［9］建立了10种中药血竭样品的HPLC指纹图谱，并把HPLC指纹图谱信息进行数据化及数据标准化处理，用重叠率与相关系数两个参数，从两个方面定量的对这10种样品的HPLC指纹图谱进行了相似性评价；在此基础上用系统聚类分析法定性的对这10种样品进行了分类和鉴别，从而建立了一种相对完善的中药血竭的化学模式识别技术，为中药血竭的质量评价和分类鉴别提供了一个很好的方法和思路。田兰等［10］采用HPLC对32个白术样品进行测定，将样品分析中所获得的32个样品的45个特征，采用系统聚类分析和逐步判别分析，进行白术的化学模式识别的研究。将32个样品分为优等品、一般品和伪品3个等级，优质品集中于浙江、湖南、四川一带，而北方的白术质量一般。这样就建立了评价白术真伪优劣的新方法。徐永群等［11］以赤芍的红外指纹图谱为依据，采用主成分分析法对来自18个产地的赤芍进行了聚类分析。可将18个产地大致分为6类，这一分类与地理位置有较明显的对应关系，同一区域内赤芍的性能较为相似，可作为传统中医界对赤芍药材质量评价的依据。刘谦光等［12］ 运用模糊动态聚类分析法对来源于美国、加拿大及我国的共14种不同产地的西洋参样品质量进行了模糊识别研究。结果与权威部门认定的具有法定地位的西洋参产地进行验证、核对，取得了较为一致的结果。
12 判别分析（Discriminant analysis，简称DA）在中药质量评价中的应用
判别分析是在已知研究对象分成若干类型(或组别)并已取得各种类型的一批已知样品的观测数据，在此基础上根据某些准则建立判别式，然后对未知类型的样品进行判别分类，而聚类分析是在一批给定样品要划分的类型事先并不知道，正需要通过聚类分析来给以确定类型。正因为如此，判别分折和聚类分析往往联合起来使用，所以判别分析是要求先知道各类总体情况才能判断新样品的归类，当总体分类不清楚时，可先用聚类分析对原来的一批样品进行分类，然后再用判别分析建立判别式以对新样品进行判别。
于承浩等［13］对六味地黄丸及其模拟样品在290nm下进行薄层扫描分析，将所得特征数据利用聚类分析方法进行分类，用逐步判别分析方法优选特征数据、建立判别函数，并对分类结果进行检验。结果表明，样品及模拟品被分为4类，分类合理，判别函数回判准确率为100%。从而说明了聚类判别分析方法可较好地评价六味地黄丸的质量。张亮等［14］采用反相HPLC法对六味地黄丸缺味药模拟方的浸出物进行分析，选取9个色谱峰的峰面积与内标峰面积之比值作为样本特征变量，通过169个训练集样本建立了其中3种缺味药的Bayes法和PRIMA法判别分析数学模型。结果3种缺味药4种模式的平均正确识别率Bayes法和PRIMA法均为100%，对169个预示集样本的平均预示率Bayes法为100%，PRIMA法为99.6%。表明Bayes法和PRIMA法能对六味地黄丸3种缺味药进行准确识别。
13 主成分分析法（Principal components analysis，简称PCA）在中药质量评价中的应用
根据在初选的特征量间可能存在的相关性，找到一种空间变换方式，通过对原始特征（经标准化后的）变量进行线性组合，形成若干个新的特征矢量，要求它们之间相互正交，它既保留了原始指标的主要信息，且又互不相关。这样一种从众多原始指标之间相互关系入手，寻找少数综合指标以概括原始指标信息的多元统计方法成为主成分分析。其数学模型为：设有m个指标X1，X2，…，Xm，欲寻找可以概括这m个指标主要信息的综合指标Z1，Z2，…，Zm。从数学上讲，就是寻找一组常数ai1，ai2，…，aim（i=1，2，…，m），使这m个指标的线性组合：Z1=a11 X1＋a12 X2＋…＋a1m XmZ2=a21 X1＋a22 X2＋…＋a2m Xm Zm=am1 X1＋am2 X2＋…＋amm Xm能够概括m个原始指标X1，X2，…，Xm的主要信息(其中，各Zi（i=1，2，…，m）互不相关)。这些矢量即称为主成分。该方法就是根据样本特点，选取与问题最相关的特征来参与分类的。近年来主成分分析法在中药质量鉴别分析中应用比较广泛［15-17］。
张耀奇等［18］运用气相色谱法结合主成分分析对16种苍术及类似品、30种相关成药（二妙丸、三妙丸、四妙丸等）进行了研究。该方法是将气相色谱分离得到去除杂质峰的整个色谱图化分成237个时间通道，凡在时间通道内不出峰就以“0”表示，出峰的以实际峰面积表征。由此，每一样本均可用一个237维的向量表示，采用shannon信息量方程计算每一时间通道的信息量，最后选取信息量最大的十几个通道作为分类特征。结果显示，苍术和白术有明显区别；茅苍术和北苍术虽为药典规定的正品苍术，但就挥发性化学成分来看，两者有明显区别；北苍术和关苍术区别不大。三种相关成药，以三妙丸较有特征，有别于其它两种。孙红祥等［19］从常用的10种天南星药材中选取与抗肿瘤、镇咳祛痰作用相关的13种成分作为评价指标，并运用主成分分析方法从这13个指标中提取了4个主因子，其累积贡献率达91.4％，能较近似的代表原始数据所反映的信息，得到权重系数较大的X1、X2、X4、X7、X8、X11和X12等7个指标，然后再采用模糊数学的方法对这些药材的质量进行综合评价。结果表明，一把伞南星最佳，其次为象头花和掌叶半夏，粗序南星质最劣。因此，应用主成分分析和模糊数学方法建立的数学模型进行中药材的质量评价是可行的。马龄等［20］采用气相色谱法对中药吴茱萸脂肪酸进行了分析测定，根据测定的数据用主成分分析法进行特征压缩、提取，将代表诸样品特征的点即“星”显示在半圆形极坐标上构成星座图，根据“星”所属的星座和所走的路径，对18种不同品种、不同产地的吴茱萸进行自然分类，为中药吴茱萸的品种鉴别和质量优选提供了依据。张亮等［21］利用主成分分析法对32个不同品种来源的中药石斛样品质量进行了研究，该法直接用药材粉末的氯仿浸出液的紫外光谱数据进行分析，以每一波长与特定波长的吸光度比值作为分类指标，用Shannon信息理论对全部样品计算每一波长通道的信息量，选取信息量最大的10个通道用作分类特征，取得了满意的分类结果，为从化学角度研究中药质量提供了一种新的方法。曾明等［22］应用主成分分析法对来源于不同产地的野葛及葛属的其它8种植物进行了化学模式识别研究，为葛属植物的药材质量评价及分类提供了依据。王秀坤等［23］运用主成分分析法及非线性映射技术，对来源于全国各地的40份苦参药材质量进行了化学模式识别研究，取得了与传统鉴定较为一致的结果。
14 逐步回归分析（Stepwise regression，简称SR）在中药质量评价中的应用
逐步回归分析［24］是进行双向筛选的一种方法，当引入一个自变量进入方程后，要对方程中的每一个自变量作基于偏回归平方和的F检验，看是否需要剔除一些退化为“不显著”的自变量，以确保每次引入新变量之前方程中只包含有“显著”作用的自变量。这一双向筛选过程反复进行，直到既没有自变量需要引入方程，也没有自变量从方程中剔除为止，从而得到一个局部最优的回归方程。
到目前为止，此种方法在中药质量评价中应用的比较少。张汉明等［25］为了考察化学成分与药理活性之间的内在联系，建立合理的化学模式识别方程，因此选择了葛根的有效成分总黄酮、葛根素、大豆苷元、大豆苷、3′甲氧基葛根素及多糖的含量和葛根清热解表功效有关的抗内毒素活性强度为化学和药理指标，运用逐步回归法建立了回归方程，同时采用Bayers判别分析法对来自全国不同产地的葛根及同属的其它植物进行了模式识别研究。结果黄酮类成分未进入方程，而多糖与抗内毒素活性呈显著的负相关；6因素和单因素的判别正确率分别为94.12％、88.24％。本研究也为中药材质量评价提供了一个新的依据。
15 典型相关分析（Canonical correlation analysis，简称CCOR）在中药质量评价中的应用
典型相关分析是研究变量之间相关关系的一种统计分析方法，它揭示两组随机变量之间的线性相关情况。是从整体上把握两组指标之间的相互关系，分别在两组变量中提取有代表性的两个综合变量U1、V1（U1、V1分别是两个变量组中各变量的线性组合），利用这两个综合变量之间的相关性在一定程度上反映了原来两组指标之间的整体相关性。
孙立新等［26］收集不同科属、不同产地的板蓝根样品27个、大青叶样品5个。对样品的化学成分进行高效液相色谱分析，获得反映样品整体化学特征的数据，同时选择体外抑菌药理指标进行药理活性测定。用典型相关分析揭示了化学信息和药理指标之间的相关关系，寻找与药理指标密切相关的化学成分，用ISODATA聚类分析技术将32个样品划分为5类。结果用此方法评价板蓝根、大青叶的质量，结果良好，正确率为90．6％。
2 小结
多元统计分析方法运用在中药质量评价中，具有较强的科学性，在鉴定中药的真伪和质量优劣方面的研究工作已取得了可喜的进展，但现在多以单一方法为主，这样不容易把样品的特征信息完全表现出来。所以应该使多种统计方法联合运用，从而更可观的反映中药的质量，以达到中药质量全面控制的目的。相信多元统计方法会成为中药质量评价的一种科学的、全面地、准确的方法。
参考文献
1 马英丽， 赵怀清， 王学娅， 等. 不同产地黄芪的系统聚类分析. 中医药学报， 2003，31(2):20~21.
2 崔淑芬， 蒋轶伦， 王小如. 甘草药材薄层扫描指纹图谱研究. 沈阳药科大学学报， 2004，21(5):367~370.
3 王玺， 周密. 气相色谱数据的聚类分析法评价中药厚朴的质量. 沈阳药学院学报， 1990，7(1):5~7.
4 戴荣华， 马英. 牛膝质量评价方法研究中的化学模式识别. 计算机与应用化学， 2002，19(3):255~256.
5 徐永群， 孙素琴， 冯学峰， 等. 黄芩产区红外指纹图谱和聚类分析法的快速鉴别研究. 光谱学与光谱分 析， 2003，23(3): 502~505.
6 刘荣霞， 周婷婷， 董婷霞， 等. 建立评价当归质量的HPLC指纹图谱分析方法. 中国药学杂志， 2003，38(10):757~760.
7 王艳华， 李莉. 中药半夏的化学模式识别研究. 黑龙江医药， 2004，17(5):342~343.
8 马英丽， 赵怀清， 田振坤， 等. 黄芪质量的化学模式识别研究. 中草药， 2003， 34(5):460~462.
9 王继国， 雍克岚， 陈旭， 等. 中药血竭的化学模式识别研究. 上海大学学报(自然科学版)， 2004，10(1):75~78.
10 田兰， 毕开顺， 孙稳健， 等. 白术的化学模式识别. 中国中药杂志， 2003，28(2):143~146.
11 徐永群， 黄昊， 周群. 红外指纹图谱和聚类分析法在赤芍产域分类鉴别中的应用. 分析化学. 2003，31(1):5~9.
12 刘谦光， 陈战国， 张尊听， 等. 西洋参质量的化学模式识别. 中草药， 1999，30(11):852~853.
13 于承浩， 吕青涛， 王晶. 聚类判别分析方法评价六味地黄丸质量的研究. 山东中医药大学学报， 2002，26(5):375~378.
14 张亮， 刘展鹏， 杨春. 六味地黄丸缺味药的Bayes法和PRIMA法定性识别研究. 中国中药杂志， 2000，25(1):29~32.
15 周永治， 郭戎. 主成分分析法在中药鉴别中的应用. 生物数学学报， 1995， 10(3):200~204.
16 苏薇薇， 梁仁， 黄韬. 黄芩中微量元素的模糊数学处理及正品黄芩的识别. 广东微量元素科学， 1997， 4(2):60~63.
17 苏薇薇. 主成分分析法评价中药材黄芩的质量. 现代应用药学. 1990， 7(4):9~11.
18 张耀奇， 潘扬， 王天山， 等. 术类中药及其相关成药质量的主成分分析. 南京中医药大学学报， 1997， 13(3): 149~150.
19 孙红祥， 叶益萍. 天南星类药材的综合质量评价. 生物数学学报， 2003， 18(2): 243~248.
20 马龄， 王玺. 中药吴茱萸中脂肪酸气相色谱数据的化学模式识别. 计算机与应用化学， 2000， 17(1):123.
21 张亮， 马国祥， 张正行， 等. 中药石斛质量的化学模式识别. 药学学报， 1994， 29(4):290~295.
22 曾明， 张汉明， 郑水庆， 等. 中药葛根及同属植物的化学模式识别. 中草药， 1998， 29(10):652~654.
23 王秀坤， 李家实， 魏璐雪， 等. 苦参质量的化学模式识别. 中国中药杂志， 1996， 21(4):198~200.
24 孙振球. 医学统计学. 第1版. 北京: 人民卫生出版社， 2002， 249~251.
25 张汉明， 曾明， 郑水庆， 等. 中药葛根及同属植物的模式识别研究（Ⅱ）. 中草药， 2001，32(3):253~254.
关键词：痰病动物模型；中医证候；自发性高血压大鼠
中图分类号：R-33
文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)12-2506-03
动物模型是中医药研究获得突破性进展的前提条件，也是中医药科学研究要解决的关键技术问题之一。既往的研究经验证明，利用病证结合动物模型进行中医药的基础和应用研究，所得研究结果不仅能够揭示辨证论治、方证相应等中医理论的科学内涵，而且在进行临床有效方剂的疗效评价及作用机理的研究时能够真正反映中医药的特色，也易得到国内和国际生物医学同行的认可，从而推动中医药的现代化和国际化。 理想的“病证结合动物模型”，其病理生理特征和证候特征，都应该是稳定的、均一的、可重现的。目前建立“病证结合动物模型”的主要方法是通过施加不同的证候因素，在疾病模型基础上叠加证候。采用这种方法已研制了多种病证结合动物模型，如溃疡病脾虚证模型、肾阴虚型高血压模型、脾阳虚型腹水型肝癌模型等。但是，由于证候造模因素本身可控性差，使得这些病证结合动物模型不稳定、不均一，使之难以推广应用，更谈不上得到国际认可。因此，目前按此思路获得符合要求的病证结合动物模型，仍然是困难的，需要探索建立病证结合动物模型的新思路和新方法。
1.疾病动物模型同样具有证候特征
中西医学是从不同的角度来认识同一疾病的。在临床上，相对于同一个病人，与西医单纯的疾病诊断相比较，中医是辨病与辨证相结合来进行诊断，不仅观察临床病人疾病特征，更加需要观察其证候特征，即病证统一，病与证是一体化的，证在病中，病在证中，证候是对疾病病理生理变化整体反应状态的概括，是辨证的结果和论治的依据。例如对于同一个充血性心力衰竭的病人，西医诊断可能为风湿性心脏病3期，心力衰竭；而中医除也诊断为心痛病外，还将给出阳虚水泛的证候诊断。而且，不同致病因素所导致的同种疾病，可能会出现不同的中医证候；同种致病因素所致疾病，在不同的阶段，也可表现出不同的证候特征。同样地，在进行动物实验研究时，与临床诊断一样，现代医学所建立的疾病动物模型，也应该具有相应的中医证候特征，而且在疾病的进展过程中，中医证候特征是有变化的。根据动物所表现出的宏观表征，以及与临床上有关联的客观检测指标，可以对疾病动物模型的中医证候进行辨析。而实践中也发现了某些现代医学疾病模型本身确实表现出相应的证候特征，比如用弗氏佐剂所建立的风湿性关节炎模型，本身所表现出的红、肿、热、痛等症状特点，按照中医辨证当属于“热痹证”。
2.自发性疾病模型适合进行证候特征研究
现代医学研究已成功建立了多种疾病动物模型。按产生原因分类，可分为自发性动物模型和诱发性或实验性动物模型。自发性动物模型是指实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下所发生的疾病。如高血压大鼠、无胸腺裸鼠、肌肉萎缩症小鼠、肥胖症小鼠、癫痫大鼠、无脾小鼠和青光眼兔等。很多自发性动物模型在研究人类疾病时具有重要的价值，如自发性高血压大鼠、中国地鼠的自发性真性糖尿病、小鼠的各种自发性肿瘤、山羊的家族性甲状腺肿等。诱发性或实验性动物模型是指研究者通过使用物理的、化学的和生物的致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类疾病时的功能、代谢障碍使动物患相应的疾病，如用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。
相对于诱发模型，自发性疾病模型与人类疾病具有更好的相似性，因其制备或复制方法主要通过自然繁殖，不需人为附加的外界致病因素，所以其模型重复性、可靠性更强，此类模型的复制过程具有很好的可控性和简单易行性，是国际上公认的最理想的动物模型。如白发性高血压大鼠的血压是通过生物遗传和变异特性自然发展而成的，无需人为诱发因素，所获得模型成功率高，病理生理学特征稳定、均一。而作为诱发模型的肾性高血压大鼠，需通过手术减少肾脏血流来制备。由于术中操作过程复杂，术后动物需特殊护理，造模成本高，成功率低，且血压升高的均一性差，相应病理生理学特征的稳定性、均一性也难以控制。由于自发性动物模型本身的病理生理特征与诱发性动物模型相比较更为稳定、均一、可重现性强，在其自身疾病的发展过程中，中医证候特征也是相对稳定、均一的。因此，对自发性动物模型本身的证候特征进行研究辨析，更易于建立理想的“病证结合动物模型”。而且，目前对自发性动物模型病理生理的研究较为深入，为其证候特征的辨析奠定了基础。
3.辨析自发性动物模型SHR证候特征的思路与方法
3.1立题依据 自发性高血压大鼠(spoutaneously hyper-tensive rat，SHR)，是1963年日本学者Okamoto和Aoki利用生物遗传和变异特性自然发展而成的动物模型。由于SHR的自发性高血压与人原发性高血压有很多共同特征，其病理表现一般亦见于人高血压疾病，并且具有遗传特性均匀、稳定和典型的特征，在高血压的基础和应用研究中，SHR是国际公认的原发性高血压实验研究的最佳动物模型。目前SHR在全世界得到了广泛的应用，有140多个国家的研究机构都引入了该动物模型。国际顶尖权威杂志如CELL、SCIENCE、NATURE等都发表过许多采用此动物模型的研究论文。在中药新药的药效评价及复方的作用机理研究中，SHR也是应用最为广泛的动物模型。 但对于SHR的证候特征，至今尚未有人对此进行系统的研究，仅有少量的报道，SHR的证候特征目前还知之甚少。由于研究者不能明确辨析其证候特征，就难以按照中医理论特色制定研究方案和研究思路，获得的实验结果并不能完全真实反映中药复方特点，也难以为生物医学同行所接受，更谈不上得到国际认可，不能真正推动中医药防治高血压的基础和应用研究的发展。因此，系统研究SHR的证候特征及其评价技术与规范，是中医药防治高血压的基础和应用研究迫切需要解决的问题。
3.2高血压临床证型标准及其与实验室检测指标的相关性研究 传统中医学虽无“高血压”这一病名，但与高血压病相关的症状及病因、病机的描述在《内经》、《伤寒论》及《金匮要略》均有记载。近年来，由于高血压日益成为我国一个重大的公共卫生问题，极大地促进了中医药防治高血压病的临床和基础研究，建立了高血压的临床证候诊断及疗效评价标准。如《中药新药临床研究指导原则》(国家食品药品监督管理局，2002年)，将高血压分为肝火亢盛、痰湿壅盛、阴虚阳亢、阴阳两虚4个证型，并明确了其诊断：
(1)肝火亢盛型：具备眩晕，头痛，面红目赤，口苦，烦躁，便秘，尿赤，舌红，苔黄，脉弦等；(2)阴虚阳亢型：具备眩晕，头痛，腰膝酸软，耳鸣健忘，五心烦热，心悸失眠，舌质红，苔薄，脉弦细而数等；(3)阴阳两虚型：具备眩晕，头痛，耳鸣，心悸，行动气急，腰酸腿软，失眠多梦，舌淡或红，苔白，脉弦细等；也确定了其疗效评价标准。
对高血压证型与实验室检测指标的相关性研究，国内进行了较多的临床研究，并取得了一些进展，有些研究结果已逐渐为大家所接受，并成为辨证的参考rl。0。如证实靶器官损伤程度、外周交感一肾上腺髓质功能、肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)、性激素水平、cAMP、cGMP，cAMP／eGMP比值，血栓素，心钠素及其他血管活性物质，以及全血黏度、血浆比黏度、血沉、K值、纤维蛋白原等，与高血压主要l临床证型之间具有规律性的关联性；也发现证型与高血压病分期存在一些l临床规律。如实证类型多见于I、Ⅱ期患者，虚证类型多见于Ⅱ、Ⅲ期患者，也就是说，高血压病病情自I期向Ⅲ期发展不断加重，中医辨证则由实证类(肝火亢盛、痰湿壅盛)向虚证类(阴虚陪亢、阴阳两虚)转化，其间Ⅱ期是病变的转折阶段，多表现虚实夹杂(阴虚阳亢、痰湿壅盛)证型。
3.3高血压大鼠证候特征研究的思路 由于人与动物的差异，中医临床上辨析证候类型的四诊合参的方法，不可能完全适用于实验动物的证候特征辨析，但可以将临床定性的问诊内容，尽可能地代以定量或半定量的同等意义的观察和测试指标。通过采取宏观表征、行为学指标，以及与临床证候相关的病理形态学、免疫学、生物化学及分子生物学等实验室检测指标，建立大鼠证候特征的评价指标体系、评价方法，可以辨析模型大鼠的证候特征。如高血压肝阳上亢证大鼠模型、自发性高血压大鼠肝阳上亢证模型和不同证型大鼠高血压血管性痴呆模型，采用这种方法确认了它们的证候特征，证明是可行的。
有学者认为，中医证的动物模型的诊断依据应包括症状(本证)、病因(正证)、治疗(反证)、相关因素(佐证)、客观指标(佐证)5个方面。但如何选择可反映这5个方面的指标，以及如何采集大鼠四诊信息，使动物模型的诊断依据合乎临床标准，却是相当困难的。文献报道较多、且常用的是根据方证相应的原则，通过不同功能的药物所引起的大鼠生理指标的变化，辨析其证候属性。如(1)双肾一夹法制备的肾性高血压大鼠模型，用滋阴药时，血压没有明显变化。而用助阳药时则能进一步升高血压，从而认为是阴虚模型。(2)利用SD大鼠双肾双夹法制备的肾性高血压大鼠模型，然后灌服附子汤，6周后大鼠易激惹程度、结膜充血及血压、血浆去甲肾上腺素、肾上素、血管紧张素水平均升高，当用潜阳方(石决明、钩藤、黄芩、桑寄生、葛根、川牛膝)后，大鼠易激惹程度、结膜充血及血压、血浆去甲肾上腺素、肾上素、血管紧张素水平均较给药前降低，从而认为是肝阳上亢型。日本学者对SHR大鼠灌服中药桂附八味丸全方，能起到最好的纠正血压的作用。由于桂附八味丸全方属阴、阳双补的中药，据此认为SHR属高血压阴阳两虚模型。方证相应的原理可以有助于模型证候特征的判断，但仅依据方证相应的研究结果所确定的证候特征，是不准确的。除此之外，还应从各证型症状表现的不同之处人手，选择建立辨析高血压大鼠模型证候特征的关键指标。
3.4SHR证候特征辨析方法的初步研究与考察 目前的研究结果表明，SHR出生后第5周龄开始血压升高，10周龄雄鼠收缩压达180 mmHg，雌鼠170 mmHg，5～6月龄达高峰，7月龄后稍下降，可分为3个时期，即高血压前期(5～7周龄)、早期(4～7月龄)、晚期(12～14月龄)。其症状、体征、器官、组织学、病理学及生化指标等，也随周龄增长而发生变化。
基于此，笔者系统检索了SHR大鼠的生物学特征研究文献，以及临床高血压的辨证分型标准、高血压临床辨证分型与实验室检测指标的相关性以及中医动物模型证候特征研究等文献，并参照临床证候观察量表设计及制定标准和原则以及大鼠证候研究的文献资料，初步确定了SHR证候特征观察指标，将临床定性的问诊内容，尽可能代以定量或半定量的同等意义的观察和测试指标，包括症状、体征与行为学改变等客观指标，即一般行为、饮水量、饮食量、大便状况、毛发色泽、毛发生长速度、体温、体重、舌象、眼球突出度、眼睛色度、唾液pH值、尿量及pH值、旋转时间、痛阈、大鼠的易激惹程度、血压、心率等宏观表征和行为学指标，并建立了相应的观察和测定方法以及操作规范。根据临床证型与生物学检测指标的相关性研究的最新进展，选择并初步确定了与高血压临床证型相关的实验室检测指标。如靶器官损伤程度、生化指标、血液流变学指标、交感神经系统及肾素-血管紧张素-醛固酮系统指标、性激素水平指标、血清、尿液的代谢组学指标等。
