1998年11月，美国James和JohnGearhart领导的2个科学小组分别阐 述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞（ESce lls）和胚胎生殖细胞系（EGcells）［1，2］。ES细胞最引人关注的2条特征 是:ES细胞能在体外条件下生长，在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体 外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性，即发育成 成体中各种细胞的能力。
ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出 生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造 人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患 者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束 在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基 因运载系统。总之，其前景十分广泛。
1胚胎干细胞的一般定义特征
考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的 ，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细 胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能 性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常 的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在 体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonictissues）和分属所 有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠 外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义 限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源 于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细 胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的 是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是 十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。
2胚胎干细胞的最新研究
JamesThomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细 胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能抑制ES细胞培养的滋养外胚 层去除，内层细胞团移植到小鼠胚胎来源的成纤维细胞饲细胞层上，经过短暂的粘 附和展开的过程，将细胞重新分散（disaggregated）并转移到另外的饲细胞层， 在培养基和培养系统与方面，培养人ES细胞与小鼠ES细胞并没有太大的不同，而且 人ES细胞的成功率相对还要高一些。Thomson等人培养猴ES细胞的工作无疑对他们 首先成功培养人ES细胞是有很大帮助的。灵长类的全能性干细胞在很多方面与小鼠 ES细胞是不同的，特别是在外形上，且灵长类全能性干细胞不容易分散成单个的细 胞。因此，要正确辨认出所需的ES细胞并在传代过程中做到正确处理是十分重要的 。但还有一个重要的条件，即人胚胎培养过程的改进，其包括不同发育阶段使用不 同的培养基的两步培养系统，这使得能高效地得到高质量的人囊胚［4］。
Shamblott和同事［2］在《美国科学院论文集》上，报道从受精 5～9周的胚胎和胎儿性腺中分离出全能性细胞。尽管人们对人体中原始生殖细胞的 成熟过程的小细节知之甚少，但科学家们确实知道这个过程包括生殖母细胞迁移至 性腺并开始扩增，随后性腺出现明显的性别分化。在这个阶段的胚胎和胎儿性腺中 已经可以发现有表达生殖母细胞标志性分子的细胞［5］。Shamblott小组所使 用的培养系统利用了已知能支持小鼠生殖母细胞在体外存活和有丝分裂的一些因子 ，即STO成纤维细胞饲细胞层、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子（LIF）和f orskolin［6］。由以上2种方法培养出的细胞在多大程度上能符合ES或EG细胞 的一般标准?2种培养物都来源于全能性的细胞群，都能在体外培养过程中保持有正 常的细胞核型。Thomson小组培养出的细胞株已经传代许多次，且细胞含有端粒酶 活性，这2点都提示这个细胞株是永生的。Shamblott的EG细胞虽没有培养那么久， 但也没有迹象显示这些细胞将会死亡。从囊胚中分离出的细胞能形成包含所有3个 胚层组织的畸胎瘤，且个别组织表现为高级的组织结构性（例如可以形成神经管） 。但是在体外情况下，细胞分化的证据只能限定于能表达一些滋养层和内皮层形成 的某些标志性分子（如人绒毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白）;从生殖细胞来源的细 胞株中没有能在体内形成畸胎瘤的证据，但是作者确实观察到了在胚状体（embry oidbodies）中存在细胞进行分化的情况。胚状体是一种在不适宜干细胞生长的条 件下，由全能性干细胞在三维方向上生长所形成的一种结构。小鼠中胚状体包括两 层，一层是胚胎外的内皮层，一层是外胚层。两种细胞之间的联接可能使外胚层细 胞分化成多种细胞类型，这种现象类似于体内情况下胚胎培植早期的状况［2］ 。Shamblott将培养出来的胚状体切片，用免疫化学方法研究，发现不同细胞类型 表达分别代表中胚层、内胚层和外胚层的单个标志分子。
人的干细胞的表型，即外形、抗原表达及培养条件等方面与其他种类的全能型 细胞如小鼠的ES细胞或EC细胞相比有自己的特点。人EC细胞，猴和人的ES细胞在表 型上十分相似，与小鼠细胞或人EG细胞极易区分开来。灵长类动物细胞在单层培养 条件下呈扁平的克隆，细胞边界较清显;而小鼠ES细胞成堆生长，细胞更圆，细胞 边界不清。灵长类动物全能型干细胞表达一系列特异性的表面抗原。小鼠ES细胞的 自我更新可以被白血病抑制因子（LIF）或相关的细胞因子促进［7］但对人的 ES细胞却没有这种作用［1，2］。
在Thomson和Shamblott这2个小组的成功带动下，目前对人ES细胞的研究出现 一股热潮。如果成功，将给人类带来福音。倘若科学家最终能够成功诱导和调控体 外培养的胚胎干细胞正常地分化，这将对基础研究和临床应用产生巨大的影响。有 可能在以下领域发挥作用:体外研究人胚胎的正常发生发育，非正常发育（通过改 变细胞系的靶基因），新的人类基因的发现，药物筛选和致畸实验，以及作为组织 移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等。
3胚胎干细胞应用前景探讨
人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的及早期时期的 良好条件，这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。采用基因芯片等技术 ，比较人胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可 以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，发现新的人类基因。结合基因打靶技术， 可发现不同基因在生命活动中的功能等。该应用有利于新药的发现及筛选，人胚胎 干细胞使新药的药理、药效、毒理及药代等研究达到了细胞水平，极大减少了药物 实验所需的动物数量。目前药物实验使用的细胞系基本上来自其他的种属，其结果 常不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。人胚胎干细胞还可用来研究人类疾 病的发病机制和进展结果，从而可找到特效和永久的治疗方法。
人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官， 因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都 可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神 经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重 建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。尤其是对 于后2项，胚胎干细胞可能会有特别疗效，至今认为成年人的心脏和胰岛几乎没有 干细胞，自身无法得到修复。用于基因治疗和防止免疫排异反应，还可以对胚胎干 细胞的基因做适当的修改。干细胞是基因治疗较理想的靶细胞，因为它可以自我复 制更新，治疗基因通过它带入人体中，能够持久地发挥作用，而不象分化的细胞那 样，在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。通过胚胎干细胞和基因治疗技术，可 以矫正缺陷基因。例如，如果发现早期胚胎有某种基因缺陷而会患基因病如囊性纤 维化—一种30岁以前便会致人死亡的疾病，可以收集部分或全部胚胎干细胞，通过 基因工程技术将正常的基因替代干细胞中的缺陷基因，再将修复后的胚胎干细胞嵌 入胚胎中，将会出生一个健康的婴儿。由于伦理和某些技术问题，现在还未开展此 类实验。改变胚胎干细胞的某些基因的另一目的是创建“万能供者细胞”，即破坏 细胞中表达组织相容性复合物的基因，躲避受者免疫系统的监视，从而达到防止免 疫排异反应的发生。但这种方法需要破坏和改变细胞中许多基因，而且这种细胞发 育成的组织和器官是否有生理缺陷?如免疫能力状况还不得而知。
另一种克服移植免疫排异的途径就是结合克隆技术创建患者特异性的胚胎干细 胞。为避免患者自身对外源细胞的免疫排异反应，ES细胞的获得还有另一种方法， 即从患者自身成熟细胞中取出细胞核，移植入去核的卵细胞中（即体细胞核转移技 术SCˉNT），经过一系列的培养在体外分化成患者所需要的细胞或组织类型。这种 包含与患者完全相同的遗传物质的杂合卵细胞在体外培养发育成囊胚，若将囊胚植 入假孕妇女的子宫中，将会克隆出与提供体细胞的人基因相同的个体，即所谓的“ 克隆人”。但是如果从获得的囊胚中分离并扩增所谓的“人胚胎干细胞（ES）”， 并体外诱导它们分化成胰岛细胞、神经元、心肌细胞等，将这些细胞移植至发病部 位，则能够修复患者的组织或器官，从而使患者得到康复。用这种胚胎干细胞培养 获得的细胞、组织或器官，其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与提供体 细胞的患者完全一致，不会导致任何免疫排异反应。如果能成为现实，这将是人类 医学史上一项划时代的成就，它将使器官培养专业化，全面解决供体器官来源不足 的问题;并达到器官供应专一化，提供给患者相应性器官。人体中的任何器官和组 织一旦出现异常，则医生可给予更换和修复。
利用核转移克隆技术以获取ES细胞，人卵子来源不足是目前的主要难题。至今 为止，非人类哺乳动物的克隆效率非常低，大约100个以上的卵细胞才能得到1个有 活力的克隆［8，9］。要解决这个问题，一是尽快找出卵细胞中使体细胞去分 化的因子;二是寻找其他来源的卵细胞如尸体或废弃的胎儿，但这需要发展卵细胞 在体外成熟的技术。曾经有人提出将人细胞核转入去核的牛卵子以获取胚胎干细胞 ，这项技术基于一种假设，即牛细胞质中的蛋白很快被人类的蛋白所取代，从而不 会形成杂种细胞。
4面对的挑战
要使上述设想变为现实，还需要对人胚胎干细胞做深入研究，还需要解决许多 技术上的因素，这些问题包括:（1）人胚胎干细胞极易分化成其他细胞。如何维持 体外扩增时不细胞异化?虽然在防止体外培养时干细胞分化方面已取得了很大成绩 ，如在培养基中加入白血病抑制因子等可抑制干细胞分化，但仍需进一步研究干细 胞的培养条件。（2）如何定向诱导干细胞分化［10］?细胞分化是多种细胞因 子互相作用引起细胞一系列复杂的生理生化变化的过程。要诱导产生某种特异类型 的组织，就需要了解各种因子在何时何地开始作用，以及何时何地停止作用。但是 科学家相信只要将胚胎干细胞诱导分化为所需组织细胞的前提（祖细胞），将祖细 胞移植到适当的环境中就能够产生所需的组织，因为机体能够分泌所有指导细胞正 确分化的因子;并且不必在体外形成结构精确的多细胞组织后再移植，只需要将已 诱导的分散的胚胎细胞或细胞悬液注射到发病部位就可发挥作用，这些移植的细胞 与周围细胞及胞外基质相互作用便可有机地整合至受体组织中［11］。（3）要 使胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂 的器官，这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂的三维过 程。很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。例如，肺中的肌组织、血 管和结缔组织来源于中胚层，而上皮组织源自内胚层。每个细胞要获得营养和排泄 代谢产物，分化的组织中需要产生血管，组织血管化目前还处于起步研究阶段。就 目前的水平来说对来自自然机体的器官要离体培养并维持其正常的生理功能还无法 做到。器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。一种可能的方法是将干细胞 注射到重度免疫缺陷动物的脏器中，让移植的人干细胞逐步替代动物细胞，使其脏 器人源化，成为可供人体的器官移植。（4）如何克服移植后的问题?前面提到的改 变基因创建“万能供者细胞”的方法是否可行还不清楚。核移植后的卵细胞能否激 活沉默基因，启动DNA的合成，会不会改变染色体的结构等等问题，还有待进一步 研究。而且，胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向，必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的 移植的安全性做一全面、客观、深入的评价，极需人们对此作更深入的研究。
5其他替代胚胎干细胞应用的技术
由于目前胚胎干细胞的研究存在伦理与法律上的部分难点无法解决，因此人们
正在积极寻找替代胚胎干细胞的细胞的来源和技术。例如，根据现阶段的研究可以
认为只有很少的几个信号途径参与控制细胞更新和维持其全能性，那么在只有有限
分化能力的成体干细胞中激活这些途径是否能使它们保持在全能性的状态?在一些
早期胚胎的已分化细胞可以看到这种去分化的现象，例如，小鼠和大鼠卵黄囊的内
皮层细胞可以在invivo由异体分化（transdifˉferentiate）状态转变成全能性细
胞［12］，将小鼠和人的生殖母细胞用一些信号分子处理可以转变成可自我更
新的全能性细胞［1～3］。但目前主要的研究仍集中在将成体干细胞（adult
stemcells）替代胚胎干细胞的研究上。成体干细胞是指从成熟机体组织中分离出
来的干细胞，能在体外长期培养，在一定条件下能产生与所来源组织类型相同的细
胞。至今为止已在多种组织中发现并分离出干细胞，甚至在像脑、肝脏这些更新较
慢的组织中同样存在干细胞。在大部分组织中，必须通过特定的分子标志才能将干
细胞与周围无关的细胞区分开来。这些分子标志物也能为如何控制干细胞的表型提
供重要的线索。例如，表皮干细胞表达高水平的β1-integrins，而β1-inte
grins介导的细胞与胞外基质的粘附可以抑制干细胞终末分化的发生［13～16］
。据原先的推测，成体干细胞只能分化为与来源组织类型相同的细胞，即血液干
细胞只能分化出各种血液细胞，而神经干细胞只能分化出神经细胞。但是最近的一
系列研究发现说明:通过控制周围环境，成体干细胞也能够分化成多种不同类型的
细胞，表现出一定的多能性［17～20］。
Bjornson等人报道，将从小鼠前脑中的神经干细胞移植到用放射线照射处理后
的小鼠的循环系统中，可以产生出包括骨髓细胞和淋巴细胞在内的多种血液细胞，
这个结果说明神经干细胞具有比最初预想的更大的分化潜力［21］。Margaret
A.Goodell领导的小组从小鼠骨骼肌中分离出一种干细胞，它能够分化成几乎所有
种类的血液细胞，而且效力比完全的骨髓成分高10～14倍［22］。此外，陆续
还有一些发现如大鼠肝脏中的干细胞可以在体内分化成心肌细胞［23］;小鼠血
液干细胞分化成心肌细胞和血管内皮细胞［24］;人和小鼠神经干细胞分化成骨
骼肌细胞［25］;人骨髓基质干细胞分化成多种非血液型细胞［26］;人体血
液干细胞转化成肝脏细胞［27］;人神经干细胞可以转化成血液细胞和骨骼肌细
胞［28］。目前笔者尚不明白在这个发生过程中的机制。笔者注意到在血液系
统中的两个例子:在进行促分化处理前在单个的干细胞或前提细胞中能同时检测出
多种细胞类型特有的相关基因的表达［29～30］，以及当B淋巴细胞细胞的正常
分化由于Pax5的缺失被阻断后，B细胞前体细胞可以分化成多种其他类型的血液细
胞［31］。这说明干细胞在分化成某个特定细胞类型之前存在一个相对混乱的
状态，在这个状态下细胞中多种细胞类型相关的基因都会被激活。
以上的发现要应用于临床还存在操作上的困难，必须寻找一种更容易得到，更
容易控制分化的成体干细胞。目前比较理想的有人间质干细胞，这种细胞可以从成
人骨髓中分离得到，能在去分化的状态下稳定复制，并能分化成多种间质组织包括
骨、软骨、脂肪、腱、肌肉和骨髓基质等［32～33］。最近，从脂肪组织中分
离出干细胞，它能分化成脂肪、软骨、肌肉和骨组织［34］;另外从啮齿动物
真皮中得到的干细胞可以产生出神经元、神经胶质、平滑肌细胞和脂肪细胞，可能
可以作为未来理想的干细胞来源［35］。但到目前为止，成体干细胞能转化的
细胞类型还十分有限，因此只能作为胚胎干细胞研究的一个备用方案。总之，胚胎
干细胞的研究及应用，将使笔者们更加深入了解人类自身形成的过程，给人类带来
全新的医疗方法。随着研究的深入，许多目前还无法治愈的疾病有可能借助胚胎干
细胞及其相关技术而被治愈。
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【关键词】 AKT基因； 卵巢癌； siRNA； 增殖； 凋亡
The effect of RNA interference inhibited gene AKT on proliferation and apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells LIU Xiao-wen*，HU Ming-ying.*Weifang Medical University.Weifang 261000，China
【Abstract】 Objective To inhibit the key gene AKT of SKOV3 cells by RNA interference and study the effect of RNA interference on ovarian cancer cell proliferation and apoptosis.Methods Human ovarian carcinoma SKOV3 cells in vitro were divided into the control group，the empty vector group and the RNA interference group.The ovarian cancer cell proliferation，apoptosis was evaluated by MTT method and flow cytometry AnnexinV/PI assay in each group.Results MTT results showed that the cell proliferation in the RNA interference group was significantly lower as compared with the control group and the empty vector group (P 0.05).The flow cytometry AnnexinV/PI assay showed that the apoptosis rate of RNA interference group ((79.52 ± 2.31)%) was significantly higher than that of the empty vector (P
【Key words】 AKT gene； siRNA； Proliferation； Apoptosis
卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。但其发病机制尚不清楚，原癌基因的过度表达和抑癌基因的突变被认为是其主要发病机制之一。因而，在基因水平研究卵巢癌的治疗成为近年来的热点。RNA干扰技术能有效地抑制特定基因的表达，它的效果在多种肿瘤细胞系的实验中已被证实。近年来有研究表明，PI3K/AKT信号通路与卵巢癌有密切的关系［1］。为证实这一研究，本实验以PI3K/AKT信号通路的下游基因AKT为靶点，通过RNA干扰技术抑制其表达，以探讨其对人卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响。
1 资料与方法
1.1 材料 人卵巢癌SKOV3细胞株以及Mc-coy5A培养基（中国科学院上海细胞生物研究所），Lipofectamine2000（Invitrogen公司），细胞总RNA提取和RT-PCR试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma公司），AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），靶向AKT基因的siRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计与合成：（AKT-homo-413）正义链CCUGGGUAAAGAAGUCAATT，反义链UUGACUUCUUUGACCCAGGTT。
1.2 主要仪器 超净工作台，CO2培养箱，酶标仪，流式细胞仪等均有潍坊医学院实验中心提供。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养与转染 人卵巢癌SKOV3细胞株用10%胎牛血清的Mc-coy5A培养基常规培养并传代。将细胞分为三组：对照组、空白载体组与RNA干扰组。RNA干扰组：转染实验操作步骤按照Lipofectamine 2000TM产品说明书，转染前1天将5×104个细胞/孔接种于24孔培养板，细胞融合为90%～95%时进行转染，用无血清无抗生素的培养基稀释siRNA和Lipofectamine 2000，转染后6 h更换培养基，48 h后进行转染后的检测。空白载体组只添加Lipofectamine 2000，其余操作步骤同RNA干扰组。
1.3.2 细胞增殖的检测 将细胞制成细胞悬液，按4×103个细胞/孔将三组卵巢癌细胞接种于96孔板中，每组细胞设5个孔及1个空白对照组，每孔加培养基100 μl和MTT液10 μl。置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内继续孵育4 h，弃去孔内液体加入DMSO 100 μl后混匀并于接种后24 h、48 h、72 h时进行细胞增殖检测。酶标仪570 nm处测定各孔的吸光度（A值），A值越大，则表示细胞生长速度越快。
1.3.3 细胞凋亡率的检测 取对数生长期的三组细胞用0.25%的胰酶消化后，2000转离心5 min，调整细胞浓度为1×106/ml，以500 μl的结合缓冲液重悬，加入5 μl的Annexin V-FITC混匀，再加入5μl PI，混匀后避光，室温反应15 min，同时设阴性对照（不加Annexin V-FITC和PI），行流式细胞仪（美国BD公司产品）检测细胞凋亡率。
1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，三组间比较采用t检验，结果均以均数±标准差（x±s）表示，P
2 结果
2.1 细胞增殖的检测结果 应用MTT法检测三组细胞增殖的结果：RNA干扰组的增殖能力测定值显著低于对照组，差异有统计学意义（P
2.2 细胞凋亡率的检测结果 流式细胞仪法对三组细胞进行检测，自动分析细胞凋亡率。结果显示，RNA干扰组细胞凋亡率显著高于对照组，差异有统计学意义（P
3 讨论
PI3K/AKT信号通路参与很多重要的生物学过程的调控，但其过度激活可导致肿瘤的发生，在正常的组织中PI3K/AKT信号转导途径处于活化状态，但是该通路如果被过度激活，则可刺激蛋白质合成，抑制细胞凋亡等导致肿瘤的无限增殖，成为肿瘤预后不良的标志［2］。近年来，PI3K/AKT信号通路备受关注，它已被认为是肿瘤抗凋亡的主要机制之一。目前，以该通路为靶点的肿瘤治疗策略正在发展中，阻断PI3K／AKT通路也成为目前多种肿瘤治疗的热点之一［3］。相关研究指出，PI3K在约80%的早期卵巢癌细胞和一些上皮性卵巢癌中的表达均有所增高［4］。如果能有效地阻断PI3K/AKT信号通路，将为卵巢癌的治疗提供一个新的方向。
RNA干扰（RNAi）是指由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，它通过具有序列特异性的双链RNA（dsRNA）或短发夹状RNA（shRNA）与靶基因mRNA结合而导致目的基因表达下调［5，6］。RNAi技术作为一种简单、有效的工具，对目的基因有很强的抑制作用，在癌基因组功能研究和肿瘤的基因治疗中已显示出优势［7］。siRNA表达载体因具有简便、快速、成本低、转染效率高、便于稳定筛选等优点，极大促进了RNA干扰技术的应用［8］。RNA干扰技术可以选择性地沉默目的基因，抑制目的基因的表达，从而达到抑制肿瘤的增殖生长，对肿瘤起到一定的治疗作用。利用这种技术干扰卵巢癌中的相关基因对卵巢癌的治疗有着积极的作用。
本研究则通过阻断PI3K/AKT信号通路的下游通路AKT的表达，从RNA干扰的水平分析研究AKT被沉默后对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响。结果显示，AKT沉默后细胞的增殖能力明显减低，凋亡率显著增加，这一结果为卵巢癌的基因治疗以及RNA干扰技术提供了有力的证据，为卵巢癌的治疗提供了一个新的方向。卵巢癌的基因治疗以及RNAi技术用于肿瘤基因治疗必将能够成为一种常规的、有效的治疗手段。
参 考 文 献
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[关键词]组织工程血管;脱细胞组织工程血管支架;冷冻干燥
[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)02-0218-04
Conservation of the tissue-engineered acellular vascular scaffold with freezing and drying technique
LIU Bin1, ZHANG Man-jing2, XIA Wei1, LU Kai-hua1,GUO Shu-zhong1
(Department of Plastic Surgery, Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032, Shaanxi,China 2.Department of Platic Surgery,the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College)
Abstract: ObjectiveTo investigate the feasibility of a freeze-drying technique preservation protocol on the acellular vascular scaffold.MethodsAcellular vascular scaffolds were treated by freezing and drying technique at -70℃(6.67×10-4kPa) for 6h,then appraised the scaffolds by histological and ultrastructural observation and evaluated its biocompatibility and biomechanics.ResultsIt was shown that the main performance indexes of the freeze-drying treated acellular scaffolds changed unremarkably in compared with the untreated ones.ConclusionFreeze-drying technique can be a good preservation protocol for tissue-engineered acellular vascular scaffold.
Key words: tissue engineering blood vessels; tissue engineered acellular vascular scaffold; freeze drying
随着科学技术的发展,组织工程学的兴起为从根本上解决血管移植物替代这一问题带来了新的曙光。组织工程血管是组织工程学领域的产物之一,是一种新的有望彻底解决小口径人工血管移植问题的方法。脱细胞血管基质因其具有取材方便、低免疫源性、机械性能良好等优良特性,在血管组织工程研究领域中得到了越来越广泛的应用[1-2], 成为该领域支架材料研究方面的一个热点。通过前期的系列试验研究,我们初步摸索出一种脱细胞血管支架快速制备、消毒及结构疏松化的方法。然而脱细胞血管材料制备后如何长期保存又是一个需要面临和解决的问题,因此我们希望找到一种简单可行的储存技术来长期保存制备的脱细胞血管支架以达到临床和科研上 “随用随取”的目的。
在本实验研究中我们使用冷冻干燥技术处理制备的脱细胞血管支架,通过对处理后的支架材料进行组织,超微结构观察、生物力学评估、细胞毒性测定以及动物体内的组织相容性检测,研究冷冻干燥处理对脱细胞血管支架材料生物相容性和生物力学特性的影响,从而进一步评估冷冻干燥技术作为该材料长期储存方法的可行性。
1材料和方法
1.1血管材料准备及脱细胞血管支架的制备:选取8～12月,体重在2～2.5kg的健康雄性大耳白兔20只,在麻醉、相对无菌条件下,取出兔股动脉,置于4℃含青霉素和链霉素各180mg/L的无菌PBS液中,热缺血时间不超过15min。无菌PBS液冲洗数次去除血液杂质,锐性去除附属结缔组织和脂肪成分以及大部分血管外膜。截取长度为5cm、无明显分支、内径约3mm的动脉40根作为实验材料。将所取得的30根血管材料反复冻融加超高压处理后,置人含有15μg/ml RNase A,150μg/ml DNase I (Sigma)溶液中,冲洗48h(37℃,5%CO2环境内搅拌),然后用PBS洗涤1天。
1.2脱细胞血管支架的冻干处理:取20根制备好的脱细胞血管支架材料,根据血管材料口径和长度套入相应的玻璃棒上,于普通冰箱冷冻室内-4℃预冷24～48 h,然后在-80℃低温冰箱中速冻24h,再置入-70℃、6.67×10-4 kPa的干燥冷冻机(LGJ-10C,上海)内6h作冷冻干燥处理。用包装袋封装后,置常温下保存待用,并注明冻干日期、血管种类、长度及口径,保存8周以上后使用。使用时,将血管材料由包装袋中取出,浸泡于生理盐水中复温约10min,血管变软后由玻璃棒上轻轻取下,以0.1%过氧乙酸溶液消毒。
1.3组织学观察
1.3.1 光学显微镜:4%多聚甲醛分别固定经冻干-复水处理及经未冻干处理的脱细胞血管支架标本,常规石蜡包埋切片,行苏木精伊红(HE)染色后在光学显微镜下观察。
1.3.2 扫描电镜:3%戊二醛分别预固定经冻干-复水处理及经未冻干处理的脱细胞血管支架标本,4℃储存送检。标本在S-3400N型扫描电镜下观察。
1.4 兔血管内皮细胞的分离培养:无菌条件下取出兔胸主动脉。去除附壁血细胞,剪除外膜多余脂肪和筋膜。分别注入0.125%、0.25%胰酶和0.1%胶原酶消化液,使管腔充盈,37℃作用15、12、17min,松开一端,收集消化液; 注入含10%胎牛血清 M199培养液再次冲洗管腔;将消化液和冲洗液并800r/min,5min离心,弃上清;加M199培养液,吹打均匀制成细胞悬液,以2×105/瓶浓度,传入25cm2培养瓶;37℃、5%CO2培养箱,每24h半定量换液;当原代培养至融合形成致密的单层细胞时即可传代,实验采用的细胞为第3～7代细胞。
1.5 接触细胞毒性测定:实验组将约3mm2 的无菌医用粘合膜粘贴于一次性细胞培养皿中央,无菌条件下取5mm×5mm大小冻干处理后脱细胞血管基质,黏附于细胞培养皿中。作为阳性对照组,将一滴氰基丙烯酸酯滴加至另一培养皿中央的脱细胞血管基质上;阴性对照组,培养皿中央医用粘合膜粘贴未经冻干处理的脱细胞血管基质。将准备的内皮细胞悬液依次接种于上述培养皿中,CO2培养箱中(37℃,5%CO2)孵育48h后倒置荧光显微镜下观察细胞与培养皿中央材料毗邻部位的形态。
1.6羟脯氨酸含量测定:利用羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成)及多功能光度计分别测定分别测定新鲜血管及冻干处理前后脱细胞血管支架材料羟脯氨酸含量的变化。
1.7 处理前后材料的机械力学特性的测定:将新鲜血管及冻干处理前后脱细胞血管支架材料在INSTRUIN 1122生物力学测试系统(Instron Uo.USA)下行单轴拉伸试验,测定最终抗张强度和缝合强度。
1.8 血管支架材料冻干-复水处理后体内生物相容性的初步研究:大耳白兔以戊巴比妥钠(30～40mg/kg,iv)麻醉,取仰卧位固定于手术台上,腹部两侧去毛,碘伏消毒,铺巾。在腹部两侧各做2个切口,长约1cm,切开皮肤全层后以眼科剪仔细分离皮下形成一腔隙。把脱细胞血管基质及经冻干-复水处理的脱细胞血管基质分别植入皮下腔隙中,每侧植入2块材料,铺平,缝合切口,再次以碘伏消毒切口。无压力包扎,饲养。观察兔全身及材料种植局部反应,并分别于术后7天、14天、21天及28天取出标本,4%多聚甲醛分别固定血管支架标本,常规石蜡包埋切片,行苏木精伊红 (HE)染色后在光学显微镜下观察。
1.9 统计学分析:数据采用SPSS13.0软件处理,结果以均数x±s表示, 数据以均数±标准差表示,采用方差分析比较, P
2结果
2.1形态学观察
2.1.1 大体形态:脱细胞处理组管壁变软塌陷,但弹性良好(图1);经过冷冻干燥保存处理后的脱细胞血管支架形成特有的海绵状多孔性结构(图2);复水后脱细胞血管支架形态及大体结构完全复原(图3)。
2.1.2 经冻干处理脱细胞血管基质的组织学观察:经过冷冻干燥处理后的脱细胞血管支架,其管壁胶原纤维波浪状结构均保存基本完好,同未经冷冻干燥处理的脱细胞血管支架相比,结构无明显差异(图4、5)。
2.1.3 超微结构观察:经过冷冻干燥处理后的脱细胞血管支架结构较未处理前略疏松,但整体结构保持完好(图6、7)。
2.2 接触性材料细胞毒性:冻干处理前后的脱细胞血管材料均无细胞毒性,在材料的周围未发现内皮细胞的接触或者生长抑制,测试样本周围的内皮细胞形态正常,共培养的血管内皮细胞增殖旺盛(图8、9)。
2.3 正常血管与冻干处理后脱细胞血管基质的胶原含量的测定:血管材料的羟脯氨酸含量各组两两相比无统计学意义(P>0.05),即血管材料在上述各处理条件组中,其羟脯氨酸含量(胶原含量)与冻干处理前相比无明显变化,见表1。
2.4 材料的机械力学特征:血管材料的最终抗张强度与缝线保留强度各组两两相比无统计学意义(P>0.05),即血管材料在上述各处理条件组中基本力学特征在经冻干处理前后无明显变化,见表2。
2.5经过冻干处理后血管支架材料体内生物相容性
2.5.1 术区情况及植入材料大体外观:家兔腹部皮下埋植冻干处理脱细胞血管支架后,精神、食欲均良好。手术区术后第2天或第3天出现轻微红肿,术后第4天到第5天消退,埋植处高出周围皮面。切口均愈合良好,术后7天拆线。未发现明显红肿,无脓性分泌物等情况。手术后埋植脱细胞血管支架而隆起的高度随时间的推移逐渐降低,到术后3周时已基本与周围皮肤一致。
大体观察:1周组材料体外可触及、轮廓清晰、质地中、血管浸润明显、纤维包膜可与材料分离(图10)。3周组材料外周包膜变薄,与支架材料结合紧密,材料表面有降解吸收现象,失去网状状结构。4周组材料几乎完全被吸收,材料周围组织无明显坏死及感染。
2.5.2 植入材料组织学检查:2周组未经冻干处理的脱细胞血管基质及经冻干处理的脱细胞血管基质材料HE染色镜下仅见少量中性粒细胞浸润(图11、12)。3周后炎细胞数明显下降,与其下组织分界不清,包膜和材料中有中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞为主的炎性细胞浸润并伴增生的成纤维细胞。4周组材料进一步吸收变薄,呈稀疏的线条状,浸润炎性细胞数量明显减少。两组材料体内反应过程基本相同,各组均未见组织坏死。植入材料大体外观及组织学检测结果表明,脱细胞血管基质在冻干处理前后具有良好的体内生物相容性。
3讨论
传统生物材料的保存方法主要有深低温冻存和冷冻干燥保存两种。对于冻干保存生物材料的生物学特性的研究国内外已不少见,但多集中在眼角膜、骨骼及皮肤等片状材料方面。对于脱细胞血管基质支架此类管状生物材料的生物力学和化学特性影响的研究,国内外尚无文献报道。因此在我们的研究中将冷冻干燥技术应用到脱细胞血管支架此类管状生物材料的保存处理中, 以评估冻干技术作为脱细胞血管支架材料长期保存方法的可行性。
真空冷冻干燥技术是将真空技术、冷冻技术和干燥技术结合起来的一种综合性技术。其最先应用于血浆、血清、酶制剂、生物细胞、人体组织等生物制品和材料的冻干保存。早期的研究发现,部分蛋白制品通过冷冻干燥技术处理后的真空包装可以达到在室温下保存两年甚至更长时间而不发生变质的良好效果[4],从最早应用于处理生物学材料[5],后历经应用氟利昂-12改良处理法[6],直到今天使用冻干同种异体骨成功修复牙周骨缺损[7], 利用冻干技术制备多孔的组织工程支架材料[8]。冻干技术在组织保存及材料制备方面的研究走过了近六十年的发展历程。
冷冻干燥处理对于脱细胞血管材料的生物学特性的影响是本试验中主要的考察指标。主要包括材料的细胞毒性、生物力学以及生物相容性等。在我们的研究中,对经冷冻干燥保存处理的脱细胞血管基质材料的上述指标进行了体外和体内的测试。通过体外试验,我们利用兔的血管内皮细胞对经冷冻干燥处理并保存后的脱细胞血管支架的接触细胞毒性进行检测。结果发现:经过冻干保存处理的脱细胞血管基质其材料毒性并未增加,材料周围未内皮细胞形态正常且未发现内皮细胞的接触或者生长抑制。由此我们可以得出:经过冷冻干燥处理并保存的脱细胞血管基质在体外具有良好的细胞生物相容性。另外在体内试验中,我们在兔腹部皮下埋植脱细胞血管支架,通过对不同时间段取材的组织及形态学分析,初步证实了冷冻干燥处理前后,脱细胞血管支架材料都具有良好的体内生物相容性。
脱细胞血管基质的主要成分为胶原纤维,而胶原纤维的主要分解产物为羟脯胺酸。因此我们的实验中通过测定冻干保存处理前后材料羟脯胺酸的含量,来判断上述处理是否会破坏支架材料的胶原结构。结果发现经冻干保存处理前后的脱细胞血管支架其羟脯胺酸含量基本一致,从而证明冻干保存处理对于脱细胞血管支架的胶原结构无明显影响。
足够的初始强度和弹性对于组织工程血管支架的材料来说是非常重要和必需的。因此,我们在试验中测试了冻干保存处理前后血管组织的强度和弹性,以判断冻干处理对于脱细胞血管基质材料的主要生物力学指标的影响。体外测试的结果证实经过冻干保存的脱细胞血管支架其强度和弹性虽然出现了轻度的降低,但是这种改变不具有明显的统计学意义。
本研究通过对冻干保存处理前后脱细胞血管支架材料生物化学与生物力学特性的检测分析,初步证明:经过冻干保存处理的脱细胞血管材料,其细胞毒性、生物力学特征以及胶原结构与未经处理前相比没有明显的差异,冻干保存后的材料依然具有良好的生物相容性。因此我们认为:冷冻干燥处理作为组织工程脱细胞血管支架此类管状生物材料的长期储存方法是可行的。
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1生物学特性分析与比较
自1995年Grane提出骨组织工程这一概念以来,经过十几年的研究,骨组织工程在种子细胞、支架材料以及细胞-支架材料复合体等方面的研究取得了很大进展,为临床骨缺损修复重建打下了良好的基础。其中种子细胞的研究与应用主要集中在以下几种间充质干细胞:骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪干细胞、肌源性干细胞等。
MSC是一类具有多向分化潜能的干细胞,可来源于骨髓、脂肪、胎盘、脐血、脐静脉内皮下层、外周血及肌肉等各种组织中。在特定条件下可向骨、软骨、心肌、脂肪、血管内皮等间叶组织细胞转化。来源不同的MSCs,虽在生物学特性方面均表现干细胞特性,但相互之间仍有一定差异。目前对于MSCs的生物学特性研究主要集中在以下几个方面:
1.1分离培养
1.1.1骨髓间充质干细胞(BMSCs):具有来源广泛、相对容易获取、扩增表型稳定,无医学伦理学争议及过大的骨异常增殖趋势等优点,被公认为是骨组织工程最为常用的种子细胞。目前分离BMSCs的常用方法有5种:即全骨髓法、密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪法及免疫磁珠法。全骨髓法即根据干细胞贴壁特性,定期换液弃去不贴壁细胞,从而达到纯化细胞的目的;密度梯度离心法是根据BMSCs与其他细胞的密度不同而采用percoll分离液将其分离出来;贴壁筛选法则是根据BMSCs具有在塑料组织培养瓶中贴壁生长的特性对其进行分离;流式细胞仪分选法则是根据BMSC体积小、相对缺少颗粒的特性对它进行分选;而免疫磁珠法则根据细胞表面带有或缺失的抗原成分进行正选或负选,用抗体包被磁珠,获得相对纯化的细胞。其中由于经过流式或磁珠分选后的干细胞会出现增殖缓慢等一些问题,加之耗费较大和技术的难度,两者应用并不广泛。目前最为常用分离BMSCs的方法主要是全骨髓法和密度梯度离心法,由于单独应用时存在获取细胞纯度不够及数量较少等缺陷,近年有人尝试用密度梯度离心结合贴壁筛选法分离提取骨髓间充质干细胞,效果比较理想[1]。
BMSCs一般原代培养接种3～4h后开始贴壁,24h大量贴壁;2～3天见部分集落形成,大多数细胞有胞浆突起;7～10天集落迅速增多,以梭形细胞为主,胞浆丰富、核大、核染色质细、核仁明显,细胞呈平行排列或漩涡状生长;14天左右融合达80%～90%,可进行传代。传代细胞呈均匀分布生长,细胞以梭形为主。BMSC的生长潜伏适应期为1～2天,3天后进入对数生长期,6～7天后进入生长平台期。BMSC倍增时间为30～50h,细胞每传一代,细胞数约增长2倍。不同物种的BMSCs特性不尽相同,不同培养基、血清浓度、细胞接种密度、换液时间、酶消化时间、培养基pH值都会影响其生长[2]。
1.1.2脐血间充质干细胞(UC-MSCs):脐带血是脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞(HSCs)和MSCs。与骨髓相比,脐带血有更充足的来源;脐血的免疫原性较弱,能耐受更大程度上的HLA配型不符;移植物抗宿主病(GVHB)发生率较低;其间充质干细胞更为原始,扩增能力更强等优点,故脐血干细胞可作为一种新的替代细胞来源,用于各系统疾病的细胞移植及基因治疗,它的作用也越来越受到重视[3]。
目前用于UC-MSCs分离的方法同BMSCs基本相同,但UC-MSCs的分离培养和筛选与脐血样本的选择、培养基的差异以及分离、筛选过程中操作技术等多种因素有关,也无统一标准。不同培养基、不同批次的血清、不同的pH值、不同接植密度都会影响细胞的生长。一般原代培养的脐带血间充质干细胞多在培养24～48h后贴壁,1周左右成梭形,并成克隆性生长,4～5周可达80%以上的融合。原代培养的干细胞中可见多核,形态扁平的破骨样细胞混杂,一般传代至第3代时即可获得纯度较高且形态均一的长梭形的间充质干细胞[3]。
1.1.3脂肪间充质干细胞(ADMSCs):是指从脂肪组织抽吸物中获得的一种成纤维细胞形态的细胞群,具有取材容易,获得率高, 自我更新能力与多向分化潜能类似BMSCs等优势。原代培养细胞呈平行排列,漩涡样生长,细胞多为梭形、多角形等,胞浆和核仁丰富。传代培养中,经过多次传代(10～20 代),细胞的增殖速度无明显减慢,衰老和死亡细胞所占比例也很少。这表明脂肪组织蕴含丰富的干细胞,且细胞体外扩增能力很强,易于传代培养[4]。由于ADMSCs来源广泛、取材容易且分离提取方法相对简单,形态及功能均类似BMSCs,近年来日益受到研究者的重视。
目前对于ADMSCs的提取主要采用的是酶消化法,即在无菌条件下取脂肪组织,经I型胶原酶消化后离心收集沉淀再经200目细胞筛过滤获取目的细胞。同其他MSCs一样,不同组织来源的脂肪、不同实验室不同操作人员的操作技术、不同培养基、不同批次的血清、不同接种密度等也都会影响ADMSCs的生长。
1.1.4肌源性干细胞(MDSCs):骨骼肌中含有丰富的细胞成分,从原始的干细胞到终末分化的成熟细胞。近年来在骨骼肌中发现了一群被称为MDSCs的细胞群体。研究表明,它是和被证实的骨骼肌中含有的能够自我更新并向肌、骨以及脂肪组织细胞等分化的肌卫星细胞是完全不同的一类细胞群,可能是一群未向任何方向分化的原始干细胞。与BMSCs相比,其具有来源相当丰富、易于分离、易于诱导成骨等优点,使之得到越来越多研究者的重视,并在骨组织工程研究中被广泛应用。目前对于MDSCs的分离,基本上同ADMSCs,同样是在无菌条件下取特定组织块,然后经酶消化后离心、过滤。具体操作流程与细节,由于实验室条件、操作者水平等差异,而略有差异。而纯化技术主要有三种:冷冻法、Hoechst/FACS法以及Pre-plate法。其中冷冻法与Hoechst/FACS法并不常用,而Pre-plate是利用细胞贴壁速度慢的特点,经反复贴壁培养而除去非干细胞以达到分离纯化MDSCs的目的,因此有学者称之为差速贴壁法。该方法在近年MDSCs的分离纯化上逐渐得到认可并被广泛使用[5]。原代培养MDSCs的较其他细胞贴壁较慢,一般在分离后5～6h贴壁,其体积较小,呈球形,折光性强,48h后完全贴壁,并开始增生,细胞逐渐变成椭圆形或纺锤形,进一步相互融合有规律地逐渐平行排列,7～10天时,细胞90%融合,常规消化传代同其他干细胞[6]。
1.2细胞分化功能:MSCs是一类具有多向分化潜能的干细胞,在特定的诱导实验条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞等。由于来源不同,分化表型亦有一定差异。而骨组织工程常用种子干细胞在分化功能上有着统一的共性―极易诱导分化为成骨细胞。应用常规诱导培养剂:VitaminC、Beta-甘油磷酸钠以及地塞米松,均可将它们成功诱导分化为成骨细胞。另外,随着近年来对于细胞因子研究的深入,越来越多的细胞因子亦被发现具有明显的促进干细胞成骨的特性,如骨形态蛋白BMP、碱性成纤维细胞因子bFGF、转移生长因子-Beta等[7-8]。
1.3 间充质干细胞的免疫表型及鉴定:目前,认为MSCs是一个异质细胞群, 因此至今仍未发现其特异性抗原表型,且不同来源的间充质干细胞免疫表型也有不同。BMSCs表达的抗原标记主要有: SH2、SH3、CD29 、CD44、CD71、CD9、CD105、CDl06、CDl20a、CDl24、HLA-I等,而不表达其他造血细胞系的表面标记CD14、CD31、CD34、CD45、HLA-DR、CD117 等细胞表面抗原[9-10]。这些抗原均具有间质细胞特征,无特异性。而UCB-MSC表达的主要分子包括:①粘附分子,CD54、CD51、CD44、CD13等;②整合素家族成员,CD49b、CD49e、CD29等;③其他,CD90(Thy1)、SH2(CD105)、HLA-ABC、ASMA、SH3(CD166,ALCAM)、SH4(CD73)等。但不表达造血细胞的表面标志,如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8、CD2、CD15、CD16、CD19、CD24、CD33、CD 38、CD133、CD135(Flt-3)、CD117(c-kit)、Glycophorin A等,也不表达与人白细胞抗原(HLA)识别有关的共刺激分子B7-1、B7-2及主要组织相容性复合物II类分子如HLA-DR抗原等[11]。ADMSCs在免疫表型方面则较以上两者又有一定差异。苏海鹏等[12]总结了体外培养的ADMSCs表达的蛋白:①粘附分子:可表达CD9、CD29、CD49d、CD54、CD102、CD106、CD166,但不表达CD56、CD50、CD11b、CD18、CD62;②分子受体:可表达透明质酸盐(CD44)和转铁蛋白(CD71)的受体;③细胞外基质蛋白和糖蛋白:ADAS细胞能生成I和II型胶原、骨桥蛋白、ostenectin、Thy-1 (CD90) 和MUC-18 (CD146);④肌蛋白:能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白;⑤造血细胞标记:不表达造血细胞标志物CD14、CD31 或CD45;⑥补体调节蛋白: 确定能表达衰变加速因子(CD55)和补体蛋白;⑦组织相容性抗原: 表达类组织相容性蛋白HLA-ABC,而不表达类蛋白HLA-DR。目前,MDSCs由于取材、分离提纯方法及培养环境的不同,获得的MDSCs表面标志物也不尽相同。但Mastrogiacomo等[13]对比了MDSCs和BMSCs表面标志物,结果显示两者有十分相似的表达,证明两者是性质相似的MSCs,其特点为:①干细胞标志Sca-1(+)、CD34 (+/-);②早期成肌系标志Desmin、Bcl-2、C-met表达不一致;③造血干细胞标志c-kit(-)、CD45(-),其他CD10、CD13、CD56等标志物表达不一。
2在骨组织工程中的应用
鉴于上述间充质干细胞的生物学特性及各自优势,它们在骨组织工程研究中的应用越来越广泛,并在基础实验与临床应用研究两个环节都取得了可喜的成果。目前,伴随基因工程的发展,它们在骨组织工程研究中的作用得到了更大的体现和发挥。
2.1 基础研究:由于大块骨缺损修复面临的血管化难题目前还没能得到很好解决,利用骨组织工程技术仍无法满足临床上形式各异的骨缺损修复需要,因而大量的基础研究正在为解决血管化难题,尽快实现由基础研究向临床过渡而努力。Jian Zhou等[14]将兔的BMSCs与源于MSC的内皮细胞联合培养于多孔beta-磷酸三钙支架材料上构建血管化组织工程骨用以修复兔的大尺寸骨缺损。结果显示出良好的成骨和血管化效果,不仅证明该方法修复动物大块骨缺损行之有效,也是临床修复大块骨缺损很有潜力的方案。而Lei Cui等[15]利用脂肪来源的间充质干细胞复合珊瑚支架,成功修复了犬临界尺寸(20mm×20mm)颅盖骨的缺损。实验在12周与24周时分别对植入犬颅盖骨缺损处的细胞-珊瑚支架复合材料组和单纯植入珊瑚材料组做三位CT及放射图谱分析等检测,结果显示实验组较对照组骨修复体积提高了3倍多,前者基本能够达到良好修复颅盖骨缺损的要求。另外,经Rebekka等[16]研究发现UC-MSCs同BMSCs不仅在生物学特性方面有很多相似特性,与三维胶原支架复合培养实验中,经组织学、免疫组织化学、免疫印迹分析和实时定量RT-PCR等检测分析表明,UC-MSCs与BMSCs均展现了有效骨折愈合的所有特性。最后,虽然目前MDSCs在骨组织工程中的应用不如其他细胞广泛,但近年来呈现明显增长态势。Kyung等[17]对大鼠MDSCs复合壳聚糖支架于体内成骨向分化实验研究表明,凝胶壳聚糖支架是MDSCs粘附和增殖的理想基板,此外,细胞联合壳聚糖支架实验组植入体内后不光免疫反应较单纯植入支架组低很多以外,骨形成也被证实只存在于带MDSCs与骨诱导因子的凝胶壳聚糖支架材料中。
2.2 临床应用:尽管目前骨组织工程技术还没有广泛应用于临床,但近年来国内外报道的骨缺损修复临床成功病例已越来越多。其中骨髓间充质干细胞应用最早且最为常见,脂肪间充质干细胞近年来也有报道,而脐血间充质干细胞及肌源性干细胞则鲜有报道,目前还主要集中在细胞自身研究及动物基础研究阶段。Marcacci等[18]将人的BMSCs复合多孔羟基磷灰石陶瓷生物材料构建与临床患者骨缺损尺寸大小相当的组织工程骨,然后利用外科手段植入临床骨缺损处。手术早期患者无大的并发症及其他症状,手术部位亦无明显疼痛、肿胀及感染等现象,移植物在植入5～7个月时与宿主骨完全融合,跟踪调查6～7年骨结合良好且未发生迟发型骨折。最终结果证实利用骨组织工程技术能够成功修复大尺寸临床长骨骨缺损。Lendeckel等[19]则利用纤维蛋白凝胶包裹自体ADMSCs,然后应用两块可吸收板将其固定于患者颅骨缺损处,术后疗程顺利且3个月后经CT扫描观察到新骨几乎形成完整颅骨。
3 小结
间充质干细胞以其特有的优势成为组织工程理想的种子细胞,并在骨组织工程基础与应用研究中被广泛应用。但骨组织工程要想真正实现血管化进而达到临床化,对于间充质干细胞的研究仍有很长的一段路要走。MSC来源广泛但表型却有很大不同,是否是同种细胞,性质又有何特异性差别,目前尚不清楚;不同来源的MSC分化功能也有差异,如何准确控制其向某一特定方向转化也无统一标准;另外,MSC的分离提纯方法虽然很多,但同时也表明目前仍没有一种最为理想的方法来获取大量纯化的MSC。种种问题都需要我们在研究中不断地去发现、分析及解决。只有这样,MSC的价值才能在骨组织工程研究中得到最大程度的体现,真正造福于人类。
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因为与实际胃的相似性使得研究人员能够利用这个微型胃测试一些有关人类疾病的项目，例如向其注入幽门螺杆菌，一种以胃窦为目标的细菌，能够诱发胃溃疡和胃癌。据研究表明幽门螺杆菌能够导致类器官细胞以比正常速度快两倍的速度分裂，并激活一类能够引发肿瘤的特殊基因――c-Met。这些效应同时也能够在被幽门螺杆菌感染的人类胃组织中发现。这就为研究人类器官提供了更可靠的依据。
如果利用此项技术，能够培育上千个这样的类器官，而每一个类器官都由不同人的细胞培育而成，便可利用一种病原体将其感染，从而研究个体遗传学在其中扮演的角色。因此，对遗传学的贡献也有很大的前景。
现如今，首要的长期目标是能够培育个人胃组织，从而修补人体的胃溃疡。这为胃溃疡患者带来了福音。
美国加利福尼亚州斯坦福大学干细胞生物学家Calvin Kuo说：“这真的让人非常兴奋。”他表示：“能够在一个培养皿中完成这一切，这是一个了不起的技术成就。”
用来培养迷你胃的干细胞是多能性的，或者说可塑的：在适当的环境中，它们可以发育成任何类型的细胞。但在实验室的一个特定路径中诱导它们需要重新创建子宫内部精确的顺序和时间――来自蛋白质和激素的信号将告诉细胞成为什么样的组织。科学家之前曾利用这种技术在实验室的培养皿中生成了少量的肾、肺、脑和肠组织。
将多能干细胞转变成胃细胞的关键是一条相互作用的路径，其作用相当于在将组织生长为肠和胃窦之间设置的一个开关，后者是胃靠近其小肠入口的一部分。
当干细胞大约有3天大小时，研究人员加入了一些蛋白质“鸡尾酒”，包括能够抑制上述路径的头蛋白以及能够起到定时作用的维生素A中的一种化合物视黄酸。9天后，这些细胞会被放入一种蛋白浴中生长。
在第34天，生成的类器官只有直径几毫米大小，没有血细胞、免疫细胞，也没有能力处理食物或分泌胆汁。但它们的腺体结构及其发育的每个标志物都与研究人员在小鼠中获得的对照组的发育结果平行发展。主持这项研究的俄亥俄州辛辛那提儿童医院医学中心发育生物学家James Wells表示，从这个意义上说，它们“非常类似于一个实际的胃”。
这种相似性使得研究人员能够利用这个微型胃测试一些有关人类疾病的项目，例如向其注入幽门螺杆菌，后者是一种以胃窦为目标的细菌，能够诱发胃溃疡和胃癌。研究人员发现，在24小时内，幽门螺杆菌能够导致类器官细胞以比正常速度快两倍的速度分裂，并激活一类能够引发肿瘤的特殊基因――c-Met。这些效应同时也能够在被幽门螺杆菌感染的人类胃组织中发现。
[关键词] 软骨细胞；骨髓间充质干细胞；移植；转化生长因子β1
[中图分类号] R392.33[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）08（b）-016-03
Study on rabbit bone marrow mesenchymal stem cells differentiation to the chondrogenic to transplant for repairing articular cartilage
LIANG Xiao-peng，TIAN li, LI Na, WANG Zhuo, TIAN Xiao-ye, FAN Ni-na
(Shenyang Medical College, Shenyang 110034, China)
[Abstract] Objective: To observe the differentiation effect of stem cells into chondrocytes by induced rabbit bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs). Methods: Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were purified, and then cultured in inducing medium containing transforming growth factor-β1; MTT assay was employed to evaluate the proliferative activity of induced cells; immunohistochemical assay was used to detect the expression of type Ⅱ collagen; induced cells were transplanted into the knee of rabbit, and X-ray photography was employed to observe the repair and formation of cartilage. Results: MSCs could be effectively transformed into the chondrocytes by inducing medium, type Ⅱ collagen which was a specific extracellular matrix and necessary in the differentiation of MSCs into chondrocytes significantly increased, and the effects after transplantation were obvious. Conclusion: It is effective that MSCs are induced to repair articular cartilage after the transplantation. In summary, MSC is a possible ideal source of seed cells in cartilage tissue engineering.
[Key words] Chondrocytes; Mesenchymal stem cells; Transplantation; Transforming growth factor-β1
老年性骨关节炎、关节创伤等急、慢性疾病中，常因关节损伤导致关节软骨缺损。而各种原因造成的关节软骨缺损，因自身缺乏有效的修复能力，损伤后常引起疼痛和关节功能障碍等。因此，关节软骨损伤的修复一直是当今国内外学者极为关注的问题。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)来源于中胚层，有较强的自我更新和增殖能力，且取材方便，易于培养，不涉及伦理道德等问题，其最大的特点是能够实现个体化治疗，可以冷冻保存以方便临床使用,因而被认为是组织工程理想的种子细胞。它在不同诱导条件下具有向中胚层组织细胞如成骨细胞、成软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞等分化的能力[1-3]。而骨髓中存在大量的间充质干细胞，成为开展骨髓间充质干细胞研究最重要的来源[4]。作为软骨组织工程的种子细胞，骨髓间充质干细胞为软骨损伤的治疗提供了广阔的应用前景[5-7]。本实验用含转化生长因子β1的诱导液培养骨髓间充质干细胞, 使其向软骨细胞转化, 以期获得向软骨诱导效应与促进增殖效应，然后将诱导后的细胞移植于白兔膝关节内，观察移植后的效果，此法也为软骨损伤修复提供新思路[8,9]。
1 材料与方法
1.1 材料
2～3月龄健康白兔；DMEM-F12液体培养基、胎牛血清、PBS液（Gibco公司）；胰蛋白酶、EDTA、青霉素、链霉素（北京原平皓生物技术有限公司）；人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；TGF-β1(Boehringer Mannheim公司)；鼠抗兔Ⅱ型胶原单克隆抗体(Neomaker公司)；地塞米松(Sigma公司)10 U/L；bFGF(Boehringer Mannheim公司) 10 g/L；维生素C(Sigma 公司)等。
1.2 方法
1.2.1 体外实验
1.2.1.1 骨髓MSCs的获取、传代培养2～3月龄的健康白兔(沈阳医学院实验动物中心提供)，体重2～2.5 kg，雌雄不限。采用全骨髓法分离培养MSCs，白兔处死后取长松质骨和长骨，用咬骨钳剪成碎块，然后用吸管反复吹打，使骨块中的骨髓基质细胞充分溢出，500 转/min离心6 min。弃上清，加入完全培养基(含10％胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 g/ml链霉素)，反复吹打成单细胞悬液；以2×105/ml细胞密度接种于培养瓶中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱内孵育。4 d后首次全量换液，弃去大量的悬浮细胞，以后隔天换液。待细胞长满单层后，用0.025％ 的胰蛋白酶消化，以12传代。取刚接种的第2代细胞，改用诱导培养液(完全培养基含地塞米松10 mol/L，维生素C 50 g/ml，p-甘油磷酸钠10 mmol/L)培养，置37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱内孵育。倒置显微镜下每天观察细胞形态及生长情况。取第4代细胞用于实验。
1.2.1.2 MTT法测定MSCs贴壁率取生长良好的细胞消化传代，以相同密度接种于96孔板中。2、4、8、24 h后换液，去除未贴壁细胞，添加新鲜培养基200 μl，四甲基偶氮唑盐20 μl, 37℃ 孵育4～6 h。弃孔内培养液, 每孔加入200 μl DMSO, 振荡10 min, 吸出孔内液体并放入新96孔板中,在酶标仪上测定490 nm 波长处各孔的吸光度值, 并对数值进行统计学处理[10,11]。以未换液组作为对照。
1.2.1.3 骨髓MSCs的体外诱导软骨形成取第4 代MSCs , 胰酶消化, 以5×104/ml 细胞密度接种于24 孔板中，在含10%胎牛血清的完全培养液中培养，并加入地塞米松10 U/L，bFGF 10 g/L，维生素C 50 mg/L，在37℃、5％CO2孵箱内培养1周，换液2次。从第2周起用TGF-β1 10 g/L 替换bFGF，继续培养3周，随时观察细胞形态变化并摄片[10－12]。分别于诱导的第3、6、9、12 天进行MTT检测，方法同上。并以同时培养的MSCs作为对照。
1.2.1.4 Ⅱ型胶原的表达制备实验组及对照组细胞爬片，取出爬片后，以4％多聚甲醛固定，并经氧化物酶阻断溶液浸泡。正常山羊血清封闭，依次加入：一抗（鼠抗兔Ⅱ型胶原单克隆抗体），4℃过夜；二抗（生物素化羊抗鼠IgG）、链霉亲和素-过氧化物酶复合物室温孵育30 min。上述各步骤间均用PBS洗涤，然后显色，脱水，透明, 封片，计算阳性率[13－15]。
1.2.2 体内实验取牛Ⅱ型胶原酸性溶液与两倍浓度的培养液0.5 ml混合，分别加入上述诱导前后的两种MSCs，终浓度为5×105 /ml，再加入约20 g/L 冻干人纤维蛋白原，充分溶解后加入凝血酶0.1 ml (含凝血酶约25 U)。放入37℃孵箱内，5 min后即成为细胞载体复合物。分别将该复合物移植于白兔膝关节内（实验组及对照组各15例），3周后处死动物并观察培养结果。检测方法：X线观察，分别于术后4、6、8周时处死实验动物，X线摄片观察软骨修复形成情况，重点观察有无关节间隙狭窄。
1.3 统计学方法
数据以均数±标准差表示,采用SPSS 12.0统计软件进行t检验方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有高度统计学意义。
2 结果
2.1 MSCs的分离、培养
骨髓有核细胞接种48 h后开始出现细胞附壁铺伸，呈小的短梭形或三角形。第4、5天开始形成典型的呈均匀分布的骨髓MSCs簇状增生灶，且数量逐渐增多，细胞形态发生了根本变化；第1～4代细胞间的附壁和生长速度无明显区别，呈比原代更均匀的长梭形，无马蹄形细胞及悬浮细胞生长（图1）。
2.2 MSCs贴壁率检测结果
通过MTT比色试验测定各组细胞在490 nm波长处的吸光度。经统计学分析, 由图2可知，换液组与未换液组有明显差异。显微镜下观察，MSCs呈长梭形，紧密排列。
2.3 诱导液对MSCs 增殖的影响
通过MTT比色试验测定各组细胞在490 nm波长处的吸光度。经统计学分析, 由图3可知，诱导组与未诱导组有明显差异。
2.4 Ⅱ型胶原的表达
以TGF-β1 浓度为10 g/L的诱导液诱导第4代MSCs 12 d ,大量MSCs变成圆形或多边形,胞质可见清晰密集的棕褐色颗粒。对照组MSCs呈长梭形，胞质未见棕褐色颗粒。图4表示实验组阳性细胞均值与对照组阳性细胞均值比较。
2.5 X线结果
定期行双膝关节正侧位X线摄片，观察关节间隙改变及形成情况，重点观察有无关节间隙狭窄情况(表1)。
A4、A6、A8、B4、B6、B8分别为第4、6、8周检测的移植组和空白组
3 讨论
关节软骨在受到创伤后,难以自行修复。传统的治疗方法如软骨下骨钻孔术、软骨移植、骨膜或软骨膜移植、软骨细胞移植等，因其修复组织以纤维软骨为主,缺少正常透明软骨的力学性能及耐用性,而不能取得满意效果。应用组织工程方法修复关节软骨缺损展示了令人鼓舞的前景。种子细胞是组织工程化软骨形成的首要条件。骨髓间充质干细胞(MSCs)是来源于骨髓的一群非造血干细胞,在不同诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、神经细胞分化的潜能。MSCs因具有易于从骨髓中分离和体外大量扩增纯化、供区损伤小、便于自体移植、在适宜的体内或体外条件下可分化形成软骨组织等特点,而被认为是软骨组织工程最有希望的种子细胞来源之一。
本实验联合应用密度梯度离心及贴壁培养法分离MSCs，经密度梯度离心分离得到的单核细胞中，经反复传代扩增，最终获得成分单一的细胞。实验结果表明，本研究中所培养的第4代MSCs，其形态为单一的成纤维细胞样的细胞群。本研究的重点是MSCs向软骨细胞的定向诱导, 并将其移植于白兔膝关节内。研究发现转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1) 能显著刺激软骨细胞的增生、分裂和分化，因此本实验采用含转化生长因子β1的诱导液诱导MSCs向软骨分化。以含10 g/L TGF-β1的诱导液诱导第4代MSCs 12 d后,大量MSCs变成圆形或多边形,胞质可见清晰密集的棕褐色颗粒。由于Ⅱ型胶原主要存在于软骨中,因此被作为MSCs分化为软骨的主要特异性蛋白。结果发现，与未诱导组比较,诱导后的MSCs中Ⅱ型胶原表达量增多,差异有显著性。在体内移植实验中,通过定期行双膝关节正侧位X线摄片，观察到移植组和空白组的关节间隙改变及形成有明显的不同，移植组的无关节间隙狭窄结果在第6周可达80％，可见兔骨髓间充质干细胞定向诱导后移植修复关节软骨是有效的。
地塞米松、维生素C、p-甘油磷酸钠诱导液可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化, 且骨髓间充质干细胞向软骨分化所需的特异性细胞外基质Ⅱ型胶原明显升高,移植后效果明显，因此骨髓间充质干细胞有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。
随着基因工程、材料工程等技术向细胞培养领域的渗透与交叉,MSCs研究将不断深入,相信在不久的将来它有可能成为临床医生修复软骨损伤的得力工具。
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关键词Nef基因；SW480细胞；G418；稳定细胞系
艾滋病（AIDS）全称为“获得性免疫缺陷综合征”，是一种由人免疫缺陷病毒（HIV）引起的，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病.RNA干扰（RNAi）是细胞内序列特异性抑制靶基因表达的机制，具有高效性、特异性和副作用小的特点，将其应用于抗HIV1 治疗研究是近来研究热点[12].RNAi抑制HIV1的复制，最直接的方法就是利用RNAi方法直接干扰HIV1病毒的RNA，据文献报道几乎HIVl的所有基因都可作为干扰的靶点：如LTR[3]〖KG-*6〗，gag[45]〖KG-*6〗，pol[6]〖KG-*6〗，vpu[7]〖KG-*6〗，vif[5]〖KG-*6〗，tat[8]和env[9]等基因.RNAi还可以将干扰的位点靶定到细胞上与HIV病毒感染密切相关的受体蛋白、辅助受体蛋白或其他的一些细胞因子[10].
负调控因子（negative factor，Nef） 是人免疫缺陷病毒（ HIV） 附属蛋白之一，相对分子质量小，柔韧性大，核心结构呈球形.Nef 不具酶活性，具有衔接蛋白的作用，可下调 CD4，主要组织相容性复合体Ⅰ（MHCⅠ），主要组织相容性复合体Ⅱ（MHC Ⅱ）和 CD28 分子，在对抗宿主免疫应答过程中发挥重要作用.Nef 可增强病毒的复制和感染性，抑制 HIV 感染细胞的凋亡，在 HIV 致病机制方面也发挥关键作用.基于Nef在体内的致病机制，多种抗HIV1病毒策略被提出，使Nef成为潜在的HIV1靶点.本文试图构建稳定表达HIV1型Nef蛋白的SW480细胞系，为研究RNAi在艾滋病治疗方面的应用提供细胞模型.
1材料和方法
1.1材料
大肠杆菌TOP10感受态细菌、pEBMultineomyc质粒、pNL43质粒、SW480细胞（人结肠癌细胞）均由本实验室保存；RNA提取试剂TRIzol和LipofectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司； Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ与NotⅠ购自ThermoFisher公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒和去内毒试剂购自广州东盛生物科技有限公司；G418购自Sigma公司；小鼠源Antimyc抗体、内参蛋白actin抗体和HRP标记羊抗小鼠IgG均购自Santa Cruz公司；细胞培养所用的DMEM培养基和胎牛血清购自美国HyClone公司；其他常规试剂与耗材均购自于上海生工生物科技有限公司.
1.2引物设计合成
参照pNL43质粒上HIV1型Nef基因序列，利用Primer Premier 5 以及Nebcutter 2.0软件设计的引物如下：Nef正向引物，5′CGCGGATCCGGGTGGCAAGTGGGTC3′；Nef反向引物，5′ATTTGCGGCCGCTCAGCAGCTCTTGAAGTAC 3′.分别在上游引物和下游引物5′端加上了BamHⅠ和NotⅠ酶切位点和相应的保护碱基，引物由上海生工生物有限公司合成.
1.3HIV1型Nef片段的扩增
以pNL43质粒为模板，使用Ex Taq DNA聚合酶，采用PCR扩增全长HIV1型Nef基因编码区，全长640 bp.PCR扩增体系（20 μL）：10× Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.5 g/L pNL43质粒 1 μL，正向引物和反向引物（10 nmol/L）各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O 14.5 μL.PCR 的扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共进行32个循环，72 ℃继续延伸10 min.得到的PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，根据片段大小用DNA纯化试剂盒进行切胶回收.
1.4HIV1型Nef真核表达载体构建
将上述PCR产物和pEBMultineomyc质粒分别用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ双酶切后， 1%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收纯化，经T4 DNA连接酶过夜连接后转化E.coli TOP10感受态，卡那霉素LB固体培养基筛选培养，挑取阳性克隆扩增后，进行菌液PCR鉴定，提取质粒进行酶切和DNA测序鉴定.
1.5重组表达载体的瞬时表达及Western Blot检测
SW480细胞培养于添加10%胎牛血清和100×青霉素链霉素双抗混合液的DMEM培养液中，在转染前，将细胞接种于6 cm培养皿，接种量为2×106个细胞，过夜培养使其密度达80%～90%.参照LipofectamineTM2000转染试剂产品说明书，将8 μg pEBmycnef重组表达质粒转染SW480细胞，以转染空载体pEBMultineomyc质粒的SW480细胞为对照，48 h后收集细胞.冰上收获细胞，经裂解后离心取上清，加入上样缓冲液和DTT煮沸10 min.用10%SDSPAGE胶分离细胞蛋白，上样20 μg.110 V恒压80 min转至PVDF膜上.将转膜后的PVDF膜用含5%的脱脂奶粉过夜封闭.再孵育小鼠抗myc的抗体，充分洗膜，随后孵育HRP标记羊抗小鼠IgG，充分洗膜.然后各取1 mL ECL化学发光试剂A和B液混匀，5 min后平铺于膜的蛋白面，〖HJ2.1mm〗通过显影仪（Tonon公司）显影拍照.
1.6SW480细胞G418最低致死浓度的测定
将SW480细胞接种于96孔培养板中，在CO2培养箱中37 ℃培养.待细胞密度达到80%后，使用不同浓度G418（0，100， 200，300，400，500，600，700，800，900，1000 mg/L）的DMEM完全培养基培养细胞，每天更换培养基，连续观察12 d，确定全部细胞死亡的最低浓度，即为最佳的G418Y选浓度.
1.7稳定表达Nef基因的SW480细胞株的筛选和鉴定
SW480细胞接种于24孔板，培养16 h，细胞贴壁生长至汇合度达80%时，将0.8 μg pEBmycnef质粒在20μL脂质体Lipofectamine 2000TM介导下转染SW480细胞.48 h后将细胞1∶10稀释转种24孔板，同时加入终浓度为900 mg/L的G418，同时设pEBMultineomyc质粒转染对照.2～3 d换液1次，待大部分细胞死亡之后，改用450 mg/L G418的培养液维持压力筛选3周，挑出单个细胞集落，有限稀释到96孔板进行单克隆筛选，筛选出的单克隆细胞依次于48孔、12孔、6孔板及6 cm和10 cm培养皿扩大培养.扩大培养到一定量后，进行冷冻保存.剩余的一些细胞连续传代60 d以上（约30代），取一部分细胞进行Nef的RTPCR检测和Western Blot检测，确保细胞株的稳定性.
2结果
2.1HIV1 Nef基因PCR扩增结果
使用PCR方法扩增Nef基因产物，将20 μL PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，可见1条约640 bp大小的片段（如图1），片段大小符合预期，说明已成功扩增出HIV1 Nef基因.
2.2真核表达载体pEBmycNef的鉴定
2.2.1转化菌中Nef基因的PCR鉴定将上述过夜连接的产物转化E.coli Top10感受态细胞，卡那霉素LB固体培养基筛选培养，挑取4个克隆扩增后，进行菌夜PCR鉴定，结果如图2所示，琼脂糖电泳可见一条约为640 bp大小的Nef目的基因条带，与预期的条带大小吻合.
2.2.2重组表达质粒pEBmycNef的双酶切鉴定
重组载体pEBmycNef经BamH Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后，琼脂糖电泳可见一条约为640 bp大小的Nef目的基因条带，一条为10 223 bp大小的pEBMultineomyc条带（图3），说明载体构建正确.
PCR扩增的Nef全长DNA序列插入pEBMultineomyc载体，测序结果与pNL43质粒报道的Nef序列相符，表明Nef全长编码区DNA成功插入到pEBMultineomyc质粒中，且插入方向和阅读框架均正确.
2.3SW480细胞G418最低致死浓度的测定
使用G418终浓度分别为0～1 000 mg/L的DMEM培养液培养SW480细胞，观察细胞的死亡情况. 实验发现，加药后1 d，细胞形态正常，未出现明显的变化；持续筛选7 d，大量细胞开始脱落死亡，贴于培养皿底部的细胞逐渐变圆；至12 d，细胞全部死亡（图4）.确定SW480细胞全部死亡的最低浓度为900 mg/L.
2.4Nef基因在SW480细胞中的瞬时表达
将重组质粒pEBmycNef和载体质粒pEBMultineomyc分别转染SW480细胞，收集细胞，裂解后上样进行Western Blot检测，结果如图5所示.重组质粒pEBmycNef转染细胞中在约29 000处有特异性条带，而载体质粒pEBMultineomyc转染细胞中没有，表明HIVl Nef基因在SW480细胞中进行了表达.图中actin蛋白为内参蛋白.
2.5稳定表达Nef基因的SW480细胞系的鉴定
pEBmycNef质粒转染SW480细胞后，经G418抗性筛选3周后，在显微镜下挑选出了4个细胞集落，经传代扩增后，用Western Blot技术检测到Nef的表达，而空载对照SW480细胞则未检测到Nef基因的表达（图6），并且在连续传代60 d后，通过RTPCR技术和Western Blot技术，仍可以检测到 Nef基因的转录（图7）与表达（图8）.以上结果表明，已筛选到稳定表达HIV1型Nef基因的SW480细胞株.
3讨论
RNAi通过降解mRNA或抑制蛋白质来沉默基因这种技术在生物学研究领域具有极重要的意义，RNAi不仅可以作为基因功能研究与评价的方法工具，它还可以作为一种基因治疗的手段.2001年Tusehl研究组开创了RNAi技术治疗人类疾病的新途径.将RNAi用于病毒性疾病的治疗和预防研究取得了一些显著的效果，比如乙肝病毒（HBV）[13]、丙肝病毒（HCV）[14]、人瘤病毒（HPV）[15]、EB病毒[16].将RNAi应用于艾滋病治疗的文献也不计其数[17]，这些研究都为HIV1的基因治疗提供了很好的参考依据.但是RNAi还无法应用于临床治疗艾滋病，阻碍这一进程的是RNAi的传递模式.
2006年，向双林等提出利用修改过的非治病性细菌在体内及体外定向传递shRNA到靶细胞中以发挥干扰作用.他们将这种依赖细菌进行的RNAi传递技术称之为TransKingdom RNAi （tkRNAi）[18].该研究的最终目的是将这种依赖细菌进行的RNAi传递技术应用到干扰艾滋病病毒的基因研究中，试图探寻更有效的RNAi传递方法，为将RNAi应用到临床上治疗艾滋病提供理论依据.由于HIV病毒基因的RNAi干扰实验在体内无法进行，构建能够稳定表达HIV1型病毒蛋白的细胞模型显得至关重要.
本实验从pNL43质粒上扩增出Nef基因，随后与pEBMultineomyc质粒共同经BamHⅠ和NotⅠ双酶切，连接并转化构建成pEBmycnef真核表达质粒.通过菌液PCR验证、双酶切验证和DNA测序分析证明nef全长编码区DNA成功插入到pEBMultineomyc质粒中，且插入方向和阅读框架均正确.利用 LipofectamineTM 2000将重组质粒转染SW480细胞，培养48 h后，裂解细胞，收集蛋白，利用Western Blot技术检测到 Nef蛋白的瞬时表达.然后利用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法，首次建立了稳定表达HIV1型Nef基因的SW480细胞系，为研究tkRNAi在艾滋病治疗方面的应用提供了细胞模型.
⒖嘉南祝
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1 自体软骨细胞
自体软骨细胞可由关节软骨、骺板软骨、软骨膜、肋软骨和耳软骨等分离培养获得。软骨细胞是构成透明关节软骨的唯一细胞成分，是终末分化细胞，具有高度特异性。软骨细胞的主要功能是维持软骨基质成分的稳定。新分离的关节软骨细胞在最初的数天或者数周内会持续表达其特异细胞表型［1］，使其成为软骨缺损关节的“细胞治疗”中合适的细胞类型。
使用标准化的有效培养方式培养软骨细胞，年轻人群的关节软骨细胞每天仅倍增0.3倍；年龄较大患者的关节软骨细胞的增生速度更低。当软骨细胞在非三维环境中培养时，经过一段时间后(一般是3代以后)，它们的细胞表型会发生变化，发生“去分化现象”，表现得更像成纤维细胞的形态，表达Ⅰ型、Ⅲ型胶原，不再表达Ⅱ型胶原。
软骨“去分化”过程与培养条件相关。低密度接种和一些特定生长因子会促进培养的软骨细胞表达成纤维样细胞形态及相关蛋白［2］。另一方面，一些特殊培养条件会促进“去分化”的软骨细胞“再分化”，恢复软骨细胞特异的生物学行为。这些特殊的培养条件包括：旋转瓶培养；高密度微团培养；高密度和悬浮培养方法，能获得形态与功能都很稳定的软骨细胞；低氧培养；固态基质支架培养，例如将细胞接种到琼脂糖上、胶原或者藻酸盐凝胶培养。软骨组织工程中将软骨细胞接种在一些海绵状载体支架上培养，可以维持软骨细胞表型［3］。不同的细胞因子对软骨细胞特异分子的表达影响不同。转化生长因子β(TGFβ)超家族中的成员能够诱发体外培养的软骨细胞表达软骨细胞表型［3］。星型包菌素(Staurosporine)—一种蛋白激酶C抑制剂，与胰岛素样生长因子(IGF)联合应用胰岛素，或单独应用IGF，肝细胞生长因子(HGF)，和成纤维细胞生长因子(FGF)都能够促进软骨特异性细胞外基质产物的表达［5］。
应用自体软骨细胞会造成供体部位的损伤，供体软骨部位的相关研究目前尚未见文章报道。为了获得健康软骨组织，分离软骨细胞，需要额外的手术，但易带来手术相关的并发症，如感染、疼痛等。
2 同种异体软骨细胞
同种异体软骨组织作为一种移植物来源，因其独特的结构和免疫学特性，而引起研究者和临床医生的兴趣。组织学方面，软骨组织内部无血管、淋巴管和神经，其营养靠软骨基质的可渗透性从组织液中获得。软骨细胞被包裹在软骨陷窝内，软骨囊成为其天然屏障，可阻挡免疫细胞直接侵入；软骨组织具有抗原性弱、不易被机体免疫系统攻击和排斥等特点［10］。因此同种异体软骨细胞是一种值得研究的种子细胞。Wakitani即于1989年以同种异体软骨细胞组织工程化技术成功修复了兔关节软骨表面缺损［6］。大量研究结果已经证明［7］，同种异体软骨细胞可在受体内长期生长并保持分泌基质的功能，这为应用组织工程技术预制同种异体软骨组织提供了可能。同种异体来源的软骨细胞具有来源广泛、取材容易、一次可获取大量细胞、并且在三维培养环境和／或生长因子作用下可保持软骨细胞的生理特性等特点。
近年来对于胚胎来源的软骨细胞研究较多。且动物实验及多种免疫学检查证实，胚胎来源的软骨细胞所形成的新生软骨比新生及成年动物来源的软骨细胞所形成的新生软骨在受体体内存留的时间要显著延长。胚胎软骨细胞的免疫原性比异体成年细胞大大降低，提示胚胎来源的软骨细胞可以作为组织工程化软骨组织的一种种子细胞来源。
但是考虑到组织相关的免疫反应和疾病传播等方面的影响，同种异体软骨细胞用于治疗软骨缺损的方案缺乏足够的吸引力。
3 骨髓基质干细胞及其他组织来源干细胞
软骨细胞作为软骨缺损细胞治疗的种子细胞，在软骨细胞来源和体外培养条件下维持软骨细胞表型等方面有很多难题，目前尚难于解决。这引导人们研究其它类型的种子细胞。有些研究显示在体内和体外环境中，特定的条件会诱发自体骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells，BMSC)、肌肉和脂肪组织来源的干细胞表达软骨细胞表型。骨髓基质干细胞以其来源充足、取材方便、创伤小、无排斥反应、增殖能力强、可大量培养扩增等优点，被公认有可能成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。目前诱导BMSC向软骨细胞转化的实验研究已取得成功［8］。高密度接种或者低氧条件培养以及一些特殊的生长因子会促进BMSC向软骨细胞方向分化。研究表明，将离心微球化(pellet)的BMSC在含有TGFβ无血清培养液中培养，2周左右即可获得富含细胞外基质的软骨细胞，组织学检查可见软骨细胞样陷窝［9］。同样，肌肉和脂肪组织来源的干细胞经体外诱导均可表达软骨细胞表型。2003年Dragoo等证实将来源于人髌骨后脂肪垫的脂肪干细胞植入纤维蛋白胶， 经成软骨诱导后，在体外和裸鼠体内都出现成软骨的表型，有透明软骨形成。该研究提示以人脂肪干细胞为基础的软骨工程有可能在临床上用于治疗软骨缺损［10］。此外，激素类物质，如地塞米松、生长激素、甲状旁腺素、性激素以及维生素等都对骨髓间充质干细胞、肌肉和脂肪组织来源的干细胞向软骨细胞转化有诱导作用。对生长因子的作用以及生长因子与全身激素类物质之间的协同或拮抗调控方式和调控机制的进一步研究，有望使骨髓基质干细胞、肌肉和脂肪组织来源的干细胞转化的软骨细胞，早日成为软骨组织工程的充裕的种子细胞来源。但是这种细胞有一种明显的缺点，他们会进一步分化成肥大软骨细胞，甚至发生磷酸类无机物矿物质沉积和软骨内钙化［11］。
4 胚胎干细胞
种子细胞的老化是组织工程中的一大难题。一些分化和增殖能力 强的原始细胞，即干细胞，是解决这一难题的希望所在。目前研究较 多的是骨髓基质干细胞，而胚胎干细胞因其具有全能性和无限增殖的 能力，有望成为组织工程中种子细胞的新来源。胚胎干细胞是从着床 前胚胎(孕3～5 d)的内细胞团中分离所得，在体外进行培养的一种高 度未分化的细胞。目前大部分胚胎干细胞诱导软骨细胞分化的实验都 集中在小鼠实验中［12］。尚存在下述问题:(1)如何控制干细胞向特 别类型细胞分化;(2)如何分离极为纯化的干细胞也是一个难题;(3)小鼠胚胎干细胞注射在成年鼠皮下可以形成畸胎瘤，是否分化 后的种子细胞在宿主体内不具有致瘤性还不得而知。
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5 基因修饰细胞
细胞疗法和组织工程为体外基因治疗提供了理想的协同方法，因 为人体内的基因转移受安全问题和缺乏合适载体的制约。载体不用直 接进入人体，基因修饰细胞在移植前可以被广泛筛选，因此体外基因 转移是更安全的。而且，在人体内高浓度的软骨基质可能限制载体进 入细胞的通道，所以基因向软骨细胞内导入需要体外技术。人们对标 记基因如LacZ(编码半乳糖苷酶)向不同骨骼肌肉组织的转运进行了 可行性研究［13］。基因修饰过的间充质干细胞在骨科也被证明是组织修 复的有用物质［14］。此外，最近研究表明：通过腺病毒载体向人体和犬 的半月板和椎间盘细胞转染TGFβ基因后，基质的合成增加。Goto 等分别用逆转录病毒和腺病毒载体将报告基因LacZ转入犬和人的软 骨细胞，再将经基因修饰的软骨细胞移植于软骨缺损部位，结果表明前者可表达LacZ基因达3周，而后者可持续6周。在此基础上，将TGFβ基因转导入体外培养的软骨细胞，发现胶原及非胶原蛋白、蛋白聚糖的合成明显增加［15］。Nixon等将含有类胰岛素生长因子-1(IGF-1)基因的腺病毒转入马的关节软骨细胞，结果证实转染了腺病毒的软骨细胞能够维持软骨细胞的表型并且在28 d的单层培养中表达局部高含量的IGF-1，同时能够导致腺病毒积聚［16］。IGF-1能够维持正常软骨内环境新陈代谢的相对稳定并且提高软骨在体内的愈合，而腺病毒的有效积聚能够对软骨基质基因的表达和蛋白聚糖的形成有明显的促进作用。另外，有学者进一步的实验认为以成纤维细胞为中介将生长因子导入鼠的关节可以诱导软骨形成但避免了直接病毒基因转导的不足。Gelse等将负载BMP-2的腺病毒载体分别导入鼠的膝关节和成纤维细胞再将经基因修饰的成纤维细胞植入鼠的膝关节，二者比较显示直接注入BMP-2的鼠的膝关节间充质周围诱发新的软骨形成，伴随着广泛的骨赘形成；而通过成纤维细胞再导入鼠的膝关节的软骨形成仅仅在导入细胞的附近区域。更重要的是以成纤维细胞为介导的基因转导避免了腺病毒作为直接载体的强烈的免疫反应以及不良的载体的传播［17］。尽管将具有免疫抑制作用的基因转入种子细胞可克服同种异体甚至异种细胞的免疫原性，大大地拓展了软骨组织工程种子细胞的范围。但是，软骨细胞介导的基因治疗研究还处于基础研究和动物实验阶段，有待进一步探索。随着能够对转入基因进行有效的控制，形成一套合理的筛选生长因子、激素和选择有效的转染方法等问题的解决，转基因细胞将成为组织工程化软组织的种子细胞的另一大新的来源。
6 问题与展望
自体软骨细胞的体外培养技术相对比较成熟，已经开始应用于临床治疗研究，但是后四种细胞技术尚不成熟，目前还处于基础研究阶段。对于种子细胞的去分化现象、免疫原性、致瘤性、生长因子的合理选择和有效的转染方法等问题应有待于更深一步的研究和探讨。理想的软骨种子细胞应具备：(1)取材方使，供体损伤小，来源充足；(2)体外培养增殖能力旺盛，能持续保持细胞表型不变；(3)植入体内能适应受区环境并保持或恢复原有细胞的功能。尽管间充质干细胞到目前为止在软骨修复中似乎是最有前途的细胞。但仍然缺乏更深入的研究，尚不能最终判断最佳的细胞类型。因而需要进一步深入研究以明确每种细胞的优点和不足，使其在临床上都能发挥其潜能，为人类造福。 参考文献
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