发布时间：2023-03-06 16:02:59
序言：写作是分享个人见解和探索未知领域的桥梁，我们为您精选了8篇的学习周计划样本，期待这些样本能够为您提供丰富的参考和启发，请尽情阅读。
关键词：校园安全；监控系统；平安校园
中图分类号：TP277 文献标识码：A文章编号：1007-9599 (2011) 14-0000-01
Campus Security System Planning of the College of Science&Technology of Guizhou University
Jiang Ping
(College of Science and Technology of Guizhou University，Information Management and Experimental Center,Guiyang550004,China)
Abstract:Campus safety has become an issue of concern,the college began to focus on building security systems,this paper,the school building security control system described in detail to illustrate the attention to the problem,finally made a security system as a whole school of construction management of the construction of important technologies.
Keywords:Campus safety;Monitoring system;Safe campus
近年来，校园安全已成为一个大家普遍关注的问题，在容纳上千人甚至上万人的学校里，这样的问题更是突出。为提高高校在综合安全管理上的效能，给高校的安全运行提供技术保证，国家教育部提出了建立"平安校园"的综合管理平台，确保构建一个和谐平安的综合校园。贵州大学科技学院也积极的投入到“平安校园”的建设平台中来。
科技学院占地面积18万平方米，校舍建筑面积8万平方米，学生宿舍3.15万平方米，拥有在校师生近万人。针对于学员情况决定采用安防监控系统进行安全防范。安防监控系统主要对重点部位和重点区域进行实时监控，在学校的主要地点进行布控，包括学校的大门口、至宿舍楼的主要路段、宿舍楼、教学楼等地方，并通过硬盘录像机实时记录现场情况，由专人进行24小时值班监控，同时保持全天不间断连续录像并保存录像资料30天。
安防监控系统是应用光纤、同轴电缆或微波在其闭合的环路内传输视频信号，并从摄像到图像显示和记录构成独立完整的系统。它能实时、形象、真实地反映被监控对象，不但极大地延长了人眼的观察距离，而且扩大了人眼的机能，它可以在恶劣的环境下代替人工进行长时间监视，让人能够看到被监视现场的实际发生的一切情况，并通过录像机记录下来。而闭路电视监控系统是安全防范领域中的重要组成部分，系统通过遥控前端摄像机及镜头、云台等辅助设备，可以直接观察被监视场所的情况，同时可以把被监视场所的情况进行同步录像。另外，电视监控系统还可以与监听、防盗报警系统等其他安全技术防范体系联运运行。
电视监控系统由前端摄像机部分、传输部分、控制部分及显示和存储部分四大块组成。其中，监控系统前端信号包括视频、音频、报警等多种输入，前端可能是报警器、摄像头、视频编码器、摄像机等；控制信息、巡查信息、报警信息和视频信息等，按照工作流程在网络系统各级传输；通过有线或无线等传输媒介，经编码解码、调制解调、光/电或数/模转换等方式，将前端设备的图像及报警信号传输至控制设备。系统中前端监控设备及各级监控中心，均可对巡检、报警、视音频、系统日志等信息予以存储。存储和备份的报警、巡检等历史数据信息，可在网络系统中依据授权进行访问。系统应能存储下列信息并保持一定时间，可配置专用存储设备备份需要长期保存的信息。并且当监控点存在报警设备时系统应具有与报警设备联动的接口，报警发生时能切换出相应部位的视音频及报警信息，并进行记录；对某些特定监控点，可实现视频移动侦测功能；系统支持与其它业务系统进行报警联动接口。
贵大科技学院校园安防监控系统网络拓扑图如下：
贵大科技学院校园安防系统前端设计44个监控点，所有摄像机通过视频线分别接入三台视频分配器。所有接入视频分配器的视频信号一分为二，分别接入硬盘录像机和视频矩阵。矩阵主机输出的6路信号接入电视墙的监控器，通过控制键盘切换任意一路视频信号在任意监控器中显示。接入硬盘录像机的所有视频信号通过硬盘录像机进行存储录像，录像时间不少于25天。同时，所有硬盘录像机和控制电脑接入交换机，控制电脑可以通过软件对硬盘录像机进行集中管理。
关键词：项目生命周期；化工单元仿真实训；探析
一、项目生命周期
项目生命周期（Project Life Cycle）是“总体上连续的各个项目阶段的全体，项目阶段数量和名称由参加项目机构的控制需要所决定”。项目生命期最典型的形式包括四个项目生命期阶段：启动阶段（概念阶段Conceive phase）、计划阶段（开发阶段Develop phase）、实施阶段（执行阶段Execute phase）和收尾阶段（结束阶段Finish phase）。项目生命周期的每一阶段都包含一个或几个“启动―计划―执行―收尾”的循环。项目管理是通过诸如启动、规划、实施、控制与收尾等过程进行的。项目管理的过程反映了PDCA（Plan、Do、Control、Action）的原则，即事先计划、事后控制。
在化工单元仿真实训中，仿真实训项目一旦确定，便具有一般项目的特征，所不同的是，一般项目追求的是项目的成果（或完成项目产品），而教学意义上的项目则将对项目成果的追求作为学生学习活动的主线和驱动力，真正追求的是学生在获得项目成果进程中的学习和经验的增长，在化工单元仿真实训教学中，追求的是学生在获得项目成果进程中对集散控制系统（DCS）操作技能的提高。
二、基于项目生命周期的化工单元仿真实训教学的过程
基于项目生命周期理论构建化工单元仿真教学模式，将化工单元仿真教学过程分为项目的启动、计划、执行和收尾四个阶段，如下表所示。
基于项目生命周期的化工单元仿真实训教学过程
■
1.启动。这一阶段由老师和学生共同完成，首先由老师对化工单元实训项目需要培训的技能目标进行描述，并把这个实训项目作为一项任务布置给学生，学生接到任务后，查阅资料，对化工单元仿真实训项目的原理、流程图、操作步骤进行熟悉和掌握。
2.计划。按照项目生命周期理论，项目进行可行性分析后就进入到计划阶段。老师根据化工单元仿真实训项目及学生的学情制订时间表，学生在此计划的指导下掌握安全操作规范并制订记录表。
3.执行。完成项目计划后，进入到计划的执行阶段。学生根据制订的计划表，按计划实施。这时老师承担的是指导者、观察员。将化工单元仿真实训项目实训过程分为学生自主练习、问题讨论、考核三个阶段。学生通过第一阶段的自主练习，将自主练习中遇到的问题记录下来进行讨论及操作经验的交流，从而达到经验总结的目的。总结前一阶段的经验和教训后进入考核环节，考核完成后输出仿真系统成绩考核评价表。
4.收尾。根据执行过程中遇到的问题及成绩考核评价表学生进行自评、互评及老师评价。学生首先对自己的操作过程进行自我评价并进行总结，然后学生在对操作过程进行评价，查找操作过程中存在的问题并介绍自己对这类问题的处理办法。最后由老师对全组学生的实训操作进行总结和评价，对容易出现操作问题的环节和处理办法重点讲解，并对学生的操作进行点评。同时将考核成绩记录归档作为平时成绩的考核依据。
基于项目生命周期理论构建化工单元仿真教学模式，将化工单元仿真实训教学过程分为启动、计划、执行、收尾四个阶段，并将项目管理方法贯穿于整个仿真实训教学过程，使学生成为教学的主角，自主练习，自由探究，从而有利于对DCS操作技能的训练和掌握。
参考文献：
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1、原始凭证：是指直接记录经济业务、明确经济责任具有法律效力并作为记账原始依据的证明文件，其主要作用是证明经济业务的发生和完成的情况。填写原始凭证的内容为：原始凭证的名称、填制凭证的日期、编号、经济业务的基本内容（对经济业务的基本内容应从定性和定量两个方面给予说明，如购买商品的名称、数量、单价和金额等），填制单位及有关人员的签章。
2、记帐凭证：记帐凭证是登记帐薄的直接依据，在实行计算机处理帐务后，电子帐薄的准确和完整性完全依赖于记帐凭证，操作中根据无误的原始凭证填制记帐凭证。填制记帐凭证的内容：凭证类别、凭证编号、制单日期、科目内容等。
二、根据会计凭证登记日记帐。
日记帐一般分为现金日记帐和银行存款日记帐；他们都由凭证文件生成的。计算机帐务处理中，日记帐由计算机自动登记，日记帐的主要作用是用于输出现金与银行存款日记帐供出纳员核对现金收支和结存使用。要输出现金日记帐和银行存款日记帐，要求系统初始化时，现金会计科目和银行存款会计科目必须选择“日记帐”标记，即表明该科目要登记日记帐。
三、根据记账凭证及所附的原始凭证登记明细帐。
明细分类帐薄亦称明细帐，它是根据明细分类帐户开设帐页进行明细分类登记的一种帐薄，输入记帐凭证后操作计算机则自动登记明细帐。
四、根据记账凭证及明细帐计算产品成本。根据记帐凭证及明细帐用逐步结算法中的综合结转法计算出产品的成本。
五、根据记账凭证编科目汇总表。
科目汇总表也由凭证文件生成，其编制方法为对用户输入需汇总的起止日期则计算机自动生成相应时间段的科目汇总表。
六、根据科目汇总表登记总帐。
根据得出的科目汇总表操作计算机，计算机产生出对应的总帐。
七、对帐（编试算平衡表）。
对帐是对帐薄数据进行核对，以检查记帐是否正确，以及帐薄是否平衡。它主要是通过核对总帐与明细帐、总帐与辅助帐数据来完成帐帐核对。试算平衡表就是将系统中设置的所有科目的期末余额按会计平衡公式借方余额=贷方余额进行平衡检验，并输出科目余额表及是否平衡信息。一般来说计算机记帐后，只要记帐凭证录入正确，计算机自动记帐后各种帐薄应该是正确的、平衡的，但由于非法操作，计算机病毒或其他原因有可能回造成某些数据被破坏，因此引起帐帐不符，为保证帐证相符，应经常进行对帐，每月至少一次，一般在月末结帐前进行。
八、根据给出的相关内容编制本月的负债表和损益表；
将十二
月月初数视为年初数，本月视为本年数编制会计报表。
资产负债表是反映企业在某一特定日期财务状况的一种会计报表，它根据“资产=负债+所有者权益”的会计方程式，说明企业的财务状况。
损益表是反映企业在一定期间内的经营成果的会计报表，损益表按照权责发生制原则和配比原则把一个会计期间的收入与成本、费用进行配比，从而计算出报告期的净损益数。根据具体要求操作计算机得出本月的负债表和损益表。
通过此次实习，不仅培养了我的实际动手能力，增加了实际的操作经验，缩短了抽象的课本知识与实际工作的距离，对实际的财务工作的有了一个新的开始；同时也让我认识到了传统手工会计和会计电算化的有共同之处和不同之处；
一、共同点为：
1、无论是传统手工会计和电算化会计其最终目标仍是为了加强经营管理，提供会计信息，参与经济决策，提高经济效益。
2、传统手工会计和电算化会计都是遵守会计法规，会计法规是会计工作的重要依据。
3、传统手工会计和电算化会计都遵循基本的会计理论与会计方法及会计准则。
4、传统手工会计和电算化会计基本功能相同，基本功能为：信息的采集与记录、信息的存储、信息的加工处理、信息的传输、信息的输出。
5、保存会计档案。
6、编制会计报表。
二、不同点为：
1、运算工具不同传统手工会计运算工具是算盘或电子计算器等，计算过程每运算一次要重复一次，由于不能存储运算结果，人要边算边记录，工作量大，速度慢。电算化会计的运算工具是电子计算机，数据处理由计算机完成，能自动及时的存储运算结果，人只要输入原始数据便能得到所希望的信息。
2、信息载体不同；传统手工会计所有信息都以纸张为载体，占用空间大，不易保管，查找困难。电算化会计除了必要的会计凭证之外，均可用磁盘、磁带做信息载体，它占用空间小，保管容易，查找方便。
3、帐薄规则不同；传统手工会计规定日记帐、总帐要用订本式帐册，明细帐要用活页式帐册；帐薄记录的错误要用化线法和红字法更正；帐页中的空行、空页要用红线划消。电算化会计不采用传统手工会计中的一套改错方案，凡是登记过帐的数据，不得更改（当然还是要辅以技术控制），即使有错，只能采用输入“更改凭证”加以改正，以留下改动痕迹。对需要打印的帐页的空行、空页可以用手工处理。
4、帐务的处理程序（会计核算形式）不同传统手工会计处理帐务的程序有4种，但都避免不了重复转抄与计算的根本弱点，伴之而来的是人员与环节的增多和差错的增多。成熟的电算化会计的帐务处理程序用同一模式来处理不同企业的会计业务，成本核算程序以软件固化形式在计算机里，从会计凭证到会计报表的过程都由计算机处理完成后，而任何要求的输出都能得到满足。
5、会计工作组织体制不同；传统手工会计的会计组织工作以会计事物的不同性质作为制定的主要依据；电算化会计组织体制以数据的不同形态做为制定的主要依据。
6、人员结果不同；传统手工会计中的人员均是会计专业人员，其中的权威应是会计师；电算化会计中的人员由会计专业人员、电子计算机软件、硬件及操作人员组成，其中权威应为掌握电算化会计中级的会计师。
7、内部控制不同；传统手工会计对会计凭证的正确性，一般从摘要内容、数量、单价、金额、会计科目等项目来审核；对帐户的正确性一般从三套帐的相互核对来验证；还通过帐证相符、帐帐相符、帐实相符等内部控制方式来保证数据的正确，堵塞漏洞。电算化会计由于帐务处理程序和会计工作组体制的变化，除原始数据的收集、审核、编码由原会计人员进行外，其余的处理都由计算机部门负责。内部控制方式部分被计算机技术替代，由手工控制转为人机控制。
以上种种区别，集于一点，就是由于电算化会计数据处理方式的改变，引起了传统手工会计各个方面的变化，这一变化将使得系统功能更为加强，系统结构更为合理，系统管理更为完善。
会计电算化是会计史上崭新的一页。电子计算机的应用，首先带来数据处理工具的改变，也带来了信息载体的变化，电算化会计后对传统会计方法、会计理论都将发生巨大的影响，从而引起会计制度、会计工作管理体制的变革。会计电算化促进着会计的规范化、标准化，通用化促进着管理的现代化。
关键词：牛；颗粒细胞；血清饥饿；同步化；细胞周期
中图分类号：Q813；S823．3文献标识码：A文章编号：0439－8114（2012）08－1632-04
自1997年克隆绵羊Dolly诞生以来，体细胞克隆技术得到了飞速的发展，已在许多动物中获得了成功［1－4］。在体细胞克隆研究中，供体细胞的选择和制备是提高体细胞克隆效率的关键步骤［5，6］。研究者从供体细胞的类型、供体来源、培养时间、核质同步化处理方法、培养液组成等方面进行了大量研究，以期获得最好的供体细胞来提高体细胞克隆的效率。在体细胞克隆过程中，供体细胞和受体细胞核质同步化是影响克隆效率的一个关键因素。处于G0／G1期的供体细胞通常被认为是理想的进行克隆研究的供体细胞，血清饥饿是诱导供体细胞进入G0／G1期阶段的主要方法［7－9］。虽然人们尝试使用不同的血清浓度和不同的血清饥饿时间来诱导供体细胞进入G0／G1期，也取得了不错的试验结果［10，11］，但很少将血清饥饿浓度、饥饿时间及细胞传代阶段与细胞周期的同步化做深入的关联分析研究。该试验研究了牛卵巢颗粒细胞制备过程中不同的血清浓度、血清饥饿时间以及体外培养时间对细胞周期同步化的影响。
1材料与方法
1．1材料
黄牛卵巢采自贵阳市某屠宰场；胎牛血清购自Gibco公司；DPBS、胰蛋白酶、DMEM、青霉素、链霉素、DMSO和透明质酸购自Hyclone公司；RNaseA、碘化丙啶（PI）和TritonX-100购自南京凯基生物工程有限公司。
1．2牛卵巢颗粒细胞制备
黄牛卵巢从屠宰场收集后装入加有100 IU/mL 链霉素和100 IU／mL青霉素的30℃ 的DPBS中，于4 h内运回实验室。将卵巢带回实验室后以DPBS清洗2次，从卵巢表面抽取卵泡液，取2 mL卵泡液用等量的0．2％透明质酸酶消化3 min，用DMEM离心洗涤（1 500 r／min，6 min）2次，然后用DMEM调整颗粒细胞的密度为1×106个／mL，将颗粒细胞移入加体积分数10％FCS、2 mmol／L谷氨酰胺、100 IU／mL青霉素和链霉素的DMEM中进行培养。待细胞长至80％～90％时进行细胞消化传代培养。细胞消化用含0．1％胰蛋白酶和0．02％EDTA的消化液，在37．5℃下进行。细胞冷冻保存液是含有20％（V／V） FCS和5％ DMSO的DMEM。颗粒细胞培养至第2、10和25代，在0．5％和0．05％ FCS浓度下分别处理2、3、4和5 d以诱导颗粒细胞进入G0／G1期。
1．3PI染色法检测细胞周期
培养的牛卵巢颗粒细胞在37．5 ℃下用0．1％胰蛋白酶和0．02％ EDTA的消化液消化处理，然后移入5 mL离心管中用 DPBS离心洗涤（1 500 r／min，6 min）2次，再用DPBS调整细胞浓度，使每个离心管中细胞的数目达到1×105个。细胞在4 ℃ 条件下加入3 mL预冷的 70％ 乙醇进行固定，过夜。固定后的细胞用提前预冷的DPBS洗涤离心2次，然后在每管中加入含有1 mg／mL RNase A 的0．5 mL PBS，在37 ℃的水浴中处理30 min。细胞染色是在4 ℃ 条件下以0．1 mg／mL PI 和0．1％ TritonX－100避光处理2 h。染色处理结束的细胞用流式细胞仪检测其细胞周期。
1．4试验方法
1．4．1培养时间对体外培养的牛卵巢颗粒细胞G0／G1期的影响探讨牛卵巢颗粒细胞体外培养时间对其细胞周期的影响，分别将培养至第2、10和25代的牛卵巢颗粒细胞用0．5％ FCS饥饿诱导处理2 d，然后用PI染色法处理细胞，用流式细胞仪检测不同培养时间细胞的细胞周期。
1．4．2不同浓度的FCS对牛卵巢颗粒细胞G0／G1期的影响探讨血清饥饿在对诱导体外培养的牛卵巢颗粒细胞进入G0／G1期的影响，将体外培养至第5代的牛卵巢颗粒细胞分别用含0．5％ FCS和0．05％ FCS的培养液诱导处理2 d，对照组为10％ FCS。然后用PI染色法处理细胞，用流式细胞仪检测不同试验处理细胞的细胞周期。
1．4．3血清饥饿时间对牛卵巢细胞G0／G1期的影响探讨血清饥饿时间对诱导体外培养的牛卵巢颗粒细胞进入G0／G1期的影响，将体外培养至第5代的牛卵巢颗粒细胞用含0．5％ FCS的培养液分别处理2、3、4和5 d，然后用PI染色法处理细胞，用流式细胞仪检测不同处理细胞的细胞周期。
1．5统计分析
数据采用SPSS 11．5软件分析，结果以平均数±标准差来表示。
2结果与分析
2．1培养时间对牛卵巢颗粒细胞G0／G1期的影响
将培养至第2、10和25代的牛卵巢颗粒细胞用0．5％ FCS饥饿诱导处理2 d，不同培养时间对其细胞周期的影响见表1。第2、10和25代牛卵巢颗粒细胞G0／G1期的百分比分别为82．6％、84．7％和83．8％，各组之间差异不显著（P＞0．05）。
2．2不同浓度的FCS对牛卵巢颗粒细胞G0／G1期的影响
将体外培养至第5代的牛卵巢颗粒细胞用加有0．5％ FCS 和0．05％ FCS 的培养液诱导处理2 d，不同浓度的FCS对牛卵巢颗粒细胞进入G0／G1期的影响见表2。由表2可知，0．5％ FCS和0．05％ FCS试验组较对照组显著提高了G0／G1期细胞的百分比（P＜0．05），但试验组间差异不显著（P＞0．05），两者均获得了比较高比例的G0／G1期细胞，但对照组（10％ FCS）仅有62．4％的细胞处于G0／G1期。
2．3血清饥饿时间对牛卵巢颗粒细胞G0／G1期的影响
将体外培养至第5代的牛卵巢颗粒细胞用加有0．5％ FCS的培养液分别处理2、3、4和5 d，饥饿时间对诱导体外培养的牛卵巢颗粒细胞进入G0／G1期的影响见表3。从表3中可以看出，随着饥饿处理时间的增加，G0／G1期细胞的百分比呈现逐渐上升的趋势。饥饿处理5 d较2 d显著提高了G0／G1期细胞的百分比（P＜0．05），饥饿处理2 d和5 d后的G0／G1期细胞的百分比分别为81．2％和87．6％。
3小结与讨论
体细胞克隆技术中供体细胞的细胞周期和受体细胞核质同步化是影响克隆效率的一个关键因素。供体细胞处于G0／G1阶段有益于供体细胞和受体细胞的核质同步化以及重构胚的再程序化，而且能够正常的浓缩染色体，在第一次细胞分裂的末期维持正常的染色体倍数［12］。在长期的研究中，人们采用了几种不同的研究方法得到处于G0／G1阶段的供体细胞［13，14］。在供体细胞的细胞周期同步化中，人们常以血清饥饿诱导供体细胞进入G0／G1期。在牛成纤维细胞的研究中，通过0．05％浓度的血清诱导供体细胞取得了成功，同时通过延长低浓度血清诱导成纤维细胞的时间，提高了G0／G1阶段细胞的比例［15］。在当前的研究中，0．5％和0．05％浓度的FCS在诱导牛卵巢颗粒细胞获得高比例G0／G1期细胞方面没有显著差异，但0．5％和0．05％的FCS较10％的FCS显著提高了牛卵巢颗粒细胞G0／G1期细胞的比例。这表明低浓度的血清诱导可以提高牛卵巢颗粒细胞G0／G1期的比例，但不同水平的低浓度血清对诱导牛卵巢颗粒细胞进入G0／G1期没有影响。结合以前的研究报道和本试验的结果，我们发现并非血清饥饿就可以诱导体细胞获得高比例的G0／G1期，这中间除了有不同实验室工作环境和操作工艺存在差别的原因外，可能还与细胞类型及细胞来源有关。本研究中，通过延长0．5％浓度FCS对牛卵巢颗粒细胞的诱导时间，发现饥饿处理5 d的牛卵巢颗粒细胞较处理2 d的牛卵巢颗粒细胞均获得了较高的G0／G1期细胞百分比。在对牛成纤维细胞的血清饥饿诱导研究中有和本试验的结果基本一致，研究人员将血清饥饿的时间延长至14 d，得到了高比例的G0／G1期牛成纤维细胞［16］。以前的研究和我们的试验结果说明通过延长血清饥饿的时间同样可以获得高比例的G0／G1期供体细胞。
在体细胞克隆研究中，人们发现Dolly的端粒长度明显短于同龄羊，而与供体乳腺细胞的端粒长度相当。这就提出了一个问题，体细胞克隆动物是否会遗传供体核缩短了的端粒给后代，从而导致过早衰老。但之后几年大量的研究表明，端粒复原存在于大部分克隆动物中，端粒缩短可能不是造成克隆动物高死亡率的最主要原因。但在供体细胞体外制备过程中，人们又在担心体外长期培养的细胞可能会给供体细胞本身和重构胚体外培养带来负面影响。而且有人认为供体细胞衰老对重构胚的发育潜能有影响，所以通常选择体外培养短期阶段的体细胞进行克隆［17］。但大量的研究也表明，体外长期培养的细胞在重构胚构建及重构胚发育方面优于短期培养的细胞［18］。在本试验中，培养至第2、10和25代的牛卵巢颗粒细胞均获得了相近比例的G0／G1期细胞。这表明体外培养的牛卵巢颗粒细胞是否衰老对通过血清饥饿诱导细胞获得G0／G1期细胞的比例没有影响。因此，在牛卵巢颗粒细胞制备用作供体细胞的研究中，血清饥饿诱导可以提高细胞G0／G1期的比例，但不同水平的低浓度血清对诱导牛卵巢颗粒细胞进入G0／G1期没有影响，延长饥饿诱导的时间可以提高G0／G1期细胞的比例；体外传代时间对牛卵巢颗粒细胞G0／G1期细胞比例的影响不显著。
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【关键词】 血管紧张素Ⅱ; 动脉粥样硬化; 血管平滑肌细胞
【Abstract】 AngiotensinⅡ（AngII）has growth factor and cytokine-like properties . It plays an important role in the developement of atherosclerosis (AS). The effects of promoting migration， proliferation， apoptosis， phenotype translation and promoting the secretion and expression of many kinds of pro-inflammatory cytokines， growth factors and extracellular matrix proteins to vascular smooth muscle cells(VSMCs) in the progress of antherosclerosis are reviewed in this article.
【Key words】 angiotensinⅡ; atherosclerosis;vascular smooth muscle cell
动脉粥样硬化（AS）是由一系列细胞及分子参与的炎症反应性疾病。血管平滑肌细胞（VSMCs）的活化、迁移与增殖是动脉粥样硬化病变发展的必要条件［1］。 血管平滑肌细胞是动脉中膜的主要组成成分，在动脉硬化早期，在众多生长因子和细胞因子作用下，其从血管中膜迁移至内膜，进而发生表型转化并增殖，其自身也可合成多种细胞因子及生长因子，还可摄取脂质成为肌源性泡沫细胞。当脂质过分充满细胞时，细胞破裂，脂质在细胞外侧沉积，细胞本身死亡，而成为斑块中的纤维成分。其病理变化伴随着动脉粥样硬化的发生与发展。最终使血管内膜增厚，导致管腔狭窄。
血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAS）中主要的活性肽产物。近年来，大量的研究表明，Ang Ⅱ参与了动脉粥样硬化的发生、发展［2］。Ang Ⅱ可引起血管收缩，导致高血压，继发性引起AS。另外，Ang Ⅱ通过若干细胞内信号传递系统的活化，通过内皮损害或炎症状态独立于血压促进AS的发生。在AS的过程中，Ang Ⅱ有促进VSMCs迁移、增殖和凋亡的作用，并可促进其表达与分泌多种炎症细胞因子、生长因子和细胞外基质蛋白，进而促进斑块形成。其在动脉粥样硬化发生发展过程中起着重要作用。
1 血管紧张素Ⅱ及其受体的生物学功能
自从1898年发现肾素后，RAS系统对心血管系统的调节作用已被认识100多年。AngⅡ是RAS的主要活性成分，主要由循环或局部的血管紧张素原或血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）在水解酶作用下水解产生。生成Ang Ⅱ的途径有两种：一种是血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme， ACE) 途径；另一种是糜酶(chy2mase)依赖的旁路途径。前者是生成Ang Ⅱ的经典途径，主要生成循环的Ang Ⅱ，而后者是局部Ang Ⅱ生成的主要途径。AngⅡ不仅具有强烈的缩血管、升高动脉血压的作用，而且通过其受体在影响细胞生长、增殖、凋亡和调节炎症反应 、组织纤维化、凝血机制等方面起着重要病理生理作用。有证据表明，粥样硬化的动脉ACE表达增加，局部AngⅡ的生成增多， AngⅡ通过增多氧化自由基，促进黏附分子的表达，诱发炎症过程，在AS的进展中起重要作用［3］。另外在VSMCs、心肌细胞、成纤维细胞以及多种上皮来源细胞中， AngⅡ还具有促进细胞生长的作用。其促进细胞生长的机制与血小板衍生生长因子（PDGF）、c-myc、胰岛素样生长因子（insulin like growth factor-1，IGF-1）和转化生长因子等作用有关。
AngⅡ通过其受体发挥生物学效应，其受体可分为血管紧张素1型受体(AT1R)、血管紧张素2型受体（AT2R)、血管紧张素3型受体（AT3R)和血管紧张素4型受体（AT4R)四种亚型，目前了解较多的是AT1R型和AT2R型， AT1R又进一步分为AT1aR 和AT1bR两个亚型。AT1R主要分布在于血管、心、脑、肾、肝脏等组织器官中 ，而AT2R主要存在于胎儿组织、肾上腺髓质、成人的脑组织，子宫、卵泡中也可见到。AT1R和AT2R均属于G蛋白耦联受体。研究表明， AT1R通过Gq激活磷脂酶C促进1， 4， 5 - 三磷酸肌醇( IP3 )和二酰甘油产生及Ca2+代谢和蛋白激酶C的激活或通过酪氨酸蛋白激酶途径激活丝裂原活化蛋白激酶等机制，完成AngⅡ收缩血管、促进细胞增殖等功能。在成熟组织中，几乎所有已知的AngⅡ作用都是通过AT1R所介导的。这些作用包括:血管平滑肌收缩、醛固酮的分泌、致渴反应， 肾重吸收钠， 升压及心动过速反应。而AT2R通过与第三个胞内环激活Gi和酪氨酸磷酸酶通路，灭活胞外信号调节激酶而实现其抑制生长的作用。AT2R主要表达于胎儿，因此其生物学活性主要表现为: （1）在胎儿肾中诱导细胞分化; （2）抑制细胞肥大、增殖，诱导凋亡。目前研究表明AT1R和AT2R在细胞增长和增殖、血管张力、血管肾素的释放等方面作用相反。但是，有关ATR的生物学特性的具体机制还不完全清楚，有待进一步的研究。
2 血管紧张素Ⅱ对动脉粥样硬化中血管平滑肌细胞的作用
AS中，Ang Ⅱ可促进VSMCs迁移、增殖及其表型转化，并有促进VSMCs各种炎性细胞因子、生长因子及细胞外基质蛋白表达与分泌的作用，致AS斑块逐渐形成。
2．1 Ang Ⅱ对VSMCs表型转化、迁移及增殖的作用 VSMCs可分为收缩型和合成型两种表型。正常成人动脉血管内的平滑肌细胞以收缩型为主，主要功能是维持血管的弹性和收缩血管，而合成型分化程度低或处于未分化状态，合成和分泌基质蛋白能力强，主要功能是增殖、迁移入内膜和合成基质，主要位于胚胎中期血管或病理血管中［4］。Ang Ⅱ可促进VSMCs由收缩型转变为合成型，并获得迁移、增殖和合成、分泌大量细胞外基质（ECM）的能力，严重时引发血管重构，促进AS病变的发生与发展［5］。
景涛等［6］研究发现，体外培养的大鼠VSMCs在基础状态下也存在AT1R的表达，给予Ang Ⅱ刺激后，在短时间内迅速使VSMCs内AT1R表达上调，刺激大鼠VSMCs发生跨膜迁移并使VSMCs内肌动蛋白组装为整齐的应力纤维网；而预先给予AT1R拮抗剂CV-11974处理后再给予Ang Ⅱ，结果使AT1R表达下调。AT1R拮抗剂CV-11974可明显抑制VSMCs内应力纤维丝形成，并呈浓度依赖性抑制AngⅡ介导的VSMCs迁移；AT2R拮抗剂PD123319对VSMCs应力纤维丝形成和VSMCs跨膜迁移细胞数均无显著的影响，同时阻断AT1R和AT2R后VSMCs的跨膜迁移细胞数及应力纤维丝形成情况与单独阻断AT1R时差异无显著性。提示不同浓度的Ang Ⅱ可能是通过AT1R介导来调节VSMCs内肌动蛋白组装成应力纤维网。从而发挥其介导VSMCs迁移的生物学效应。而AT2R在生物学功能上并无与AT1R相拮抗的作用。Yasunari K等［7］通过实验发现压力升高可使Ang Ⅱ介导的冠状动脉平滑肌细胞迁移增加。因而高血压是AS的危险因素之一。
Ang Ⅱ以一种有效的生长因子促进VSMCs增殖。其通过与G蛋白耦联的AT1R作用，激活细胞内的多种信号传导路径，达到促进VSMCs增殖的目的。Q.N.Diep等［8］通过实验发现，Ang Ⅱ引起的VSMCs增殖能被抑制剂氯沙坦抑制，而用AT2R抑制剂却能引起更明显的主动脉VSMCs增殖。此实验结果表明AT1R具有介导Ang Ⅱ促VSMCs增殖的作用，而AT2R并不具有此作用。实验中用AT2R抑制剂后使更多的Ang Ⅱ与AT1R结合，致使Ang Ⅱ的促增殖作用更显著。
2．2 Ang Ⅱ对VSMCs炎性细胞因子表达与分泌的作用 对AS斑块的免疫学研究发现， Ang Ⅱ可刺激血管内皮细胞、斑块内的巨噬细胞、平滑肌细胞 （SMC）、成纤维细胞等产生多种炎性细胞因子，促进炎症反应的发生与发展。对于VSMCs，Ang Ⅱ可通过其表面受体介导，进而活化细胞内若干信号传导系统，促进单核细胞趋化蛋白1（MCP1）、IL-6、IL-18Rα等多种炎性细胞因子的表达，参与AS发生发展的多个阶段。
在AS发生、发展的多个阶段，促进斑块的不稳定及破裂过程中，MCP1均起了重要作用。Chen等［9］证实AngⅡ可通过 AT1R介导机制刺激培养的鼠大动脉平滑肌细胞（RASMCs） 内 MCP1 的基因表达， 并且这种诱导依赖于对氧化还原反应敏感信号转递事件，包括 NADH/NADPH氧化酶的激活、H2O2产生等，这种诱导同样依赖于蛋白酪氨酸磷酸化和丝裂原活性蛋白激酶（MAPK）活性的级联放大作用。Funakoshi 等［10］发现 Rho 激酶也参与介导AngⅡ诱导的鼠平滑肌细胞对MCP1表达的过程。Binlin等［11］证实AngⅡ通过抑制核糖核酸酶活性增加VSMCs MCP1 mRNA稳定性及其表达。
促炎细胞因子IL-6有诱导VSMCs迁移、增殖的作用，可加速AS炎症反应，并促进斑块向不稳定的方向发展。Ang Ⅱ通过AT1R启动VSMCs内信号传递系统，并呈剂量依赖性地促进IL-6表达［12］。有实验表明，Ang Ⅱ通过核因子kB、cAMP应答元件结合蛋白和组蛋白乙酰基转移酶P300和SRC-1介导的细胞外信号调节激酶依赖的组蛋白乙酰化作用促进IL-6mRNA表达［13］。Ruwen Cui等［14］首先提出Ang Ⅱ可通过Rho-phospho-Ser536RelA途径调节VSMCs IL-6表达。Ang Ⅱ也可促进VSMCs表面IL-18Ra表达，从而强化IL-18诱导炎症基因的表达，Ang Ⅱ与IL-18之间信号通路的交互作用可增强VSMCs炎症基因的表达，使AS进一步恶化［15］。Ang Ⅱ刺激炎性细胞产生分泌细胞因子，它们共同刺激肝细胞、内皮细胞产生和分泌CRP，CRP也可反作用于AngⅡ，影响AngⅡ的作用。Wang等［16］研究发现CRP可以上调VSMCs表面AT1R的表达，从而协同AngⅡ的生物学效应。AngⅡ促进VSMCs表达与分泌炎症介质的作用伴随着AS的发生与发展。
2．3 AngⅡ对VSMCs生长因子及细胞外基质蛋白的表达与分泌的作用 AS中，AngⅡ可促进VSMCs表达及分泌多种生长因子，如TGF-β1、血小板源性生长因子（PDGF）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、表皮生长因子（HB-EGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）、epiregulin、结缔组织生长因子（CTGF）等。TGF- β1 对VSMCs具有生长抑制或诱导其增生的双向调节作用，低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用；而其他由VSMCs分泌的生长因子有协同AngⅡ促进细胞增殖的作用。有研究表明PDGF可通过促进NOR1表达介导平滑肌细胞的增殖［17］，而且PDGF可促进VSMCs表达与分泌bFGF和激活成纤维细胞生长因子1型受体(FGFR-1)，通过FGFR-1对ERK的持久激活，达到促进细胞增殖的目的［18］。AngⅡ具有促进VSMCs发生表型转化的重要作用。当VSMCs发生表型转化后，其可表达及分泌大量的细胞外基质，纤维连接蛋白、胶原及弹力蛋白等合成增加，这些细胞外微环境的改变将更有利于细胞的迁移及增殖。同时VSMCs分泌的部分生长因子，也有促进胞外基质合成与聚集的作用。 例如TGF-β1就具有调节细胞外基质（ECM）蛋白，增加纤连蛋白(FN)、蛋白聚糖和胶原蛋白合成，阻滞基质蛋白降解的作用［19］。因而TGF-β1在调节AS斑块的稳定性方面起着举足轻重的作用。另外有研究表明，AngⅡ也可通过p38MAPK依赖途径而非TGF-β1依赖机制激活Smad路径，刺激VSMCs合成细胞外基质［20］。
2．4 AngⅡ对VSMCs凋亡的作用 AngⅡ的AT1R和AT2R两型受体均有介导VSMCs凋亡的作用。Hong Song等［21］通过TUNEL染色发现AngⅡ作用的VSMCs组比对照组细胞凋亡指数明显增加，AngⅡ加AT1R抑制剂氯沙坦组比AngⅡ组细胞凋亡指数增加，而AngⅡ加AT2R抑制剂PD-123319组比AngⅡ组细胞凋亡指数减少，但与对照组比较增加，AngⅡ加两型受体抑制剂氯沙坦和PD-123319组细胞凋亡指数明显比前几组低，此结果表明，AngⅡ对AT1R和AT2R激活均有介导VSMCs凋亡的作用，而AT2R介导VSMCs凋亡的作用更明显。而Q.N.Diep等［8］通过实验证实AngⅡ通过AT1R介导的增殖比凋亡作用更显著。AngⅡ可促进VSMCs表达TGF-β1，而TGF-β1可通过ALK/smads途径调节VSMCs的凋亡［22］。那么AngⅡ是否有依赖于TGF-β1的信号途径促进细胞凋亡呢？已有证据表明AngⅡ通过TGF-β1依赖途径促进肾小管细胞凋亡［23］。Santiago等［24］用TGF-β1抗体或ALK抑制剂作用于培养的VSMCs，结果并不能抑制AngⅡ诱导细胞凋亡的作用，并进一步证实AngⅡ通过AT1R激活p38MAPK途径诱导细胞凋亡，不依赖于TGF-β1/ ALK/ smads 路径。
Emilio Ruiz等［25］证实细胞内摄的AngⅡ对VSMCs凋亡也具有重要作用。近期有研究表明， AngⅡ所致的VSMCs凋亡与AKT磷酸化抑制和胞膜fasL表达增加有关［26］。可能因为这两种信号传导路径与AngⅡ细胞内摄有关，而内摄的AngⅡ可致最终的胞核内DNA裂解。AngⅡ的细胞内摄是通过AT1R介导的，β-抑制蛋白通过AT1R胞质网格结合蛋白与受体连接介导AT1R- AngⅡ复合体内摄，参与 AngⅡ的部分内摄作用［27］。
总而言之，AngⅡ有调节VSMCs增殖与凋亡的作用，但在VSMCs表面主要表达AT1R，AT2R只有少量表达，因而AngⅡ诱导细胞增殖比凋亡的作用显著，最终的结果是诱导VSMCs增殖，血管壁逐渐增厚，致管腔狭窄。
3 展望
综上所述，AngⅡ可通过VSMCs表面受体介导，激活细胞内复杂的信号传导系统，促进细胞迁移、增殖、凋亡及表型转化，并有促进细胞表达及分泌多种生长因子、炎性细胞因子及细胞外基质蛋白的作用，促进AS斑块的形成。当然，AngⅡ对参与AS的多种细胞都有刺激作用，诱导细胞发生病理生理变化，促进病变的发生与发展。虽然对AngⅡ与AS关系的研究越来越深入，但仍有很多问题尚待解决：（1）目前研究AngⅡ的作用主要集中在其与AT1R和AT2R上，而其与AT3R和 AT4R的作用尚未明确；（2）AngⅡ在体内可分解成AngⅢ和AngⅣ等一系列的代谢产物，它们与受体的作用及机制有待进一步明确；（3）局部的AngⅡ对AS的病理生理作用已有很多相关研究，但循环的AngⅡ在AS发生与发展中的作用及机制有待探讨；（4）AngⅡ对参与AS多种细胞的作用及分子机制有待进一步完善；（5）AngⅡ与TGF-β1、IL及ox-LDL等一些参与AS病理过程因子间的交互对话作用有待进一步明确。深入了解AngⅡ对AS的病理生理作用及其分子机制，对进一步研究AS形成过程具有重要意义，并为临床抗AS用药提供科学依据，将为临床AS的有效治疗提供新思路。
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摘 要：目的：观察丹参对高胆固醇血症患者内皮祖细胞(endotlial progeIlitor cells，EPCs)的保护作用。方法：年龄性别匹配的健康志愿者及高胆固醇血症患者各6例入选研究，各取空腹外周血20mL，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，贴壁选择法行EPcs培养，以健康志愿者为对照组，各高胆固醇血症患者血样一分为二，分别为高胆固醇组及丹参组，丹参组培养时另添加复方丹参注射液10μg/mL，采用流式细胞术、倒置显微镜、MIT法、Boyden小室等分别观察各组EPC8数量、集落形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力。结果：高胆固醇血症患者外周血EPCs数量较对照组显著下降[(6.13±0.84)vs(24.53±3.67)，P＜0.01]，且其克隆形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力也显著降低，培养时添加复方丹参注射液使丹参组克隆形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力较高胆固醇组显著提高，但低于对照组，其中黏附能力及迁移能力虽仍较对照组低。但无统计学差异(P＞0.05)。结论：高胆固醇血症患者外周血内皮祖细胞数量下降，功能受损，复方丹参注射液对高胆固醇血症患者外周血培养的内皮祖细胞功能有保护作用。
关键词：丹参；内皮祖细胞；细胞培养；高胆固醇血症
随着内皮祖细胞(endotllelial progenitor cells，EPCs)的研究逐步深入，EPCs和动脉粥样硬化、冠心病的关系引起研究者极大兴趣。EPCs促进血管新生，参与体内血管内膜损伤的修复过程，在动脉粥样硬化早期预防中起重要作用。高胆固醇血症是动脉粥样硬化、冠心病的重要危险因素。研究发现高胆固醇血症患者外周血EPCs数量减少，功能受损。因此，寻找有效药物动员高胆固醇血症患者体内EPCs、增加外周血EPCs数量并改善其功能成为动脉粥样硬化、冠心病防治的一个研究新方向。丹参具有保护内皮细胞，改善内皮功能的作用。丹参对于与内皮细胞同一谱系的EPCs是否有保护作用呢?本实验观察高胆固醇血症患者外周血内皮祖细胞的变化及丹参的作用，以进一步明确丹参的作用机制。
1 材料
纤维连接蛋白购自Boche公司，VEGF购自PeproTechEC公司，Ⅷ因子相关抗原免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程公司，MTr购自华美生物工程公司PE-CD34购自CALTAG LABORATORIES，FITC-VE-Cadherin购自Bender systemTM公司，PE-VEGFR-2及FITC-ACl33购自R&D systems，胎牛血清、胰酶、M199、ECGS、Hank's液、PBS均购自GIBCO公司，DiI-ac-LDL购自Molecularprobe公司，Boyden小室为江苏海门麒麟医用仪器厂生产，复方丹参注射液为贵州神奇制药生产，其余为市售试剂。
2 方法
2．1 实验分组健康志愿者及高胆固醇血症患者各6例入选研究，高胆固醇血症患者的诊断参照1997年中华心血管病学分会制订的《血脂异常防治建议》，两组年龄、性别匹配。剔除外伤、溃疡、视网膜病、近期外科手术、炎症、肿瘤等影响内皮祖细胞疾病的患者，近3个月无急性心肌梗死、心绞痛发生。各取空腹外周血20mL，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，以健康志愿者为对照组，各高胆固醇血症患者血样一分为二，分别为高胆固醇组及丹参组。
2．2 人外周血EPCs培养，将分离到的单个核细胞，以5×106/cm2密度接种于包被有纤维连接蛋白的24孔培养皿中，每组每份血样各6mm，每皿加入lmL包含有20％胎牛血清、青霉素(100U/mL)及链霉素(100U/mL)的M199，丹参组每皿添加复方丹参注射液101μg/mL，其余各组添加等量培养液，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。3天后，洗去未贴壁细胞，如前添加培养液继续培养待用。
2．3 EPCs鉴定培养细胞以0.25％胰酶消化后，制成1×106/mL的单个细胞悬液，加入荧光标记的CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2或ACl33 10μL(1mg/mL)，流式细胞仪分析细胞CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及ACl33的表达。为验证培养细胞吞噬DiI-ac-LDL，将DiI-ac-LDL以2.4μg/mL的终剂量加入培养液，与细胞避光共孵育4h，洗去培养液后荧光显微镜下观察细胞荧光。以不加DiI-ac-LDL的同批培养细胞作空白对照。阴性对照采用GSC7901(胃癌细胞株)。培养细胞Ⅷ因子相关抗原的检测采用免疫组化法，空白对照不加一抗，阴性对照采用GSC7901。
2．4 外周血EPCs数量检测采用本实验室方法，取各组分离的外周血单个核细胞各1/10，制成1×106/mL的单个细胞悬液，加入荧光标记的CD34及ACl33各10μL(1mg/mL)，流式细胞仪分析细胞CD弘及ACl33的表达，以双阳性细胞为EPCs，QIleBt软件分析计数。
2．5 克隆形成能力检测培养第4天，倒置显微镜下可观察到典型细胞团，中间为大量的圆形细胞，层层叠叠，外周为纺锤形细胞，向外扩散，以大于50个细胞的细胞团为一个集落，在培养皿上下左右中5个方位各随机取一个视野(×40)计数集落数，取均值。
2．6 EPCs黏附能力检测用0.25％胰蛋白酶消化收集贴壁细胞，悬浮在500μL培养液中，计数，然后将同等数目的EPCs接种在包被纤维连接蛋白的培养板，在37℃培养30min，洗去未贴壁细胞，随机选取10个视野(×200)，倒置显微镜下计数黏附细胞数。
2．7 EPCs迁移能力检测如上述收集贴壁细胞并计数。将100IIL培养液和VEGF(50ng/mL)加入改良的Boy-den小室的下室，将2×104EPCs悬浮在15μL培养液注入上室，培养24h，刮去滤膜上面的未移动细胞，用甲醇固定，Giemsa染色，随机选择5个显微镜视野(×200)计数迁移到低层的细胞。
2．8 EPCs增殖能力试验如上述收集贴壁细胞并计数。再将等量EPCs接种到包被纤维连接蛋白的96孔培养板，每孔加10μL MTI(5me/mL)，培养4h后，吸弃上清液，再加入二甲基亚砜(150μL/孔)，于微量振荡器充分振荡10min，置酶标仪测OD490值。
2．9统计学处理方法采用单因素方差分析比较各组均数，P＜0.05为有显著性差异。
3 结果
3．1 EPCs鉴定培养3天洗去不贴壁细胞及碎片后，可见典型细胞集落：呈白色半透明，略高于培养平面，中间为大量的圆形细胞，层层叠叠，外周为纺锤形细胞，向外扩散。6天后流式细胞仪分析示细胞表达CD34，VE-Cadherin，VEGFR-2及ACl33。荧光显微镜检显示：随培养时间的延长，越来越多的细胞吞噬DiI-ac-LDL，显微镜下激发红色荧光，空白对照及阴性对照均无荧光。培养2周后，Ⅷ因子相关抗原免疫组化阳性，胞浆呈棕色，空白对照及阴性对照不显棕色。
3．2高胆固醇血症患者外周血EPCs数量的变化与对照组相比，高胆固醇组外周血EPCs数量显著下降[(24.53±3.67) vs (6.14±0.84)，P＜0.01]。
3．3高胆固醇血症患者外周血EPCs功能的变化及丹参的影响见表1，与对照组相比，高胆固醇组外周血EPCs集落形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力均显著下降(均P＜0.01)；培养液中添加复方丹参注射液10μg/mL，使丹参组EPCs集落形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力较高胆固醇组均显著提高，其中黏附细胞数及迁移细胞数虽仍较对照组低[分别为：(14.79±1.93)vs(20.61±8.41)及(19.41±1.90) vs (22.27±7.98)，均
P＞0.05，但 无统计学差异。
4 讨论
众所周知，高胆固醇血症是动脉粥样硬化、冠心病的重要危险因素：ox-LDL通过对内皮细胞的氧化损伤、诱导内皮细胞凋亡等机制引起内皮功能障碍，从而启动动脉粥样硬化进程。最近的资料表明，高胆固醇血症不仅造成内皮细胞损伤，同样影响内皮祖细胞的数量和功能。2003年，Hill等在研究中观察了45例具有心血管危险因素但没有患心血管疾病的患者外周血EPCs数量变化，发现血胆固醇水平与EPCs数量呈负相关。随后，朱军慧等发现，高胆固醇血症患者不仅外周血EPCs数量明显减少，EPCs数量与血总胆固醇水平和低密度脂蛋白胆固醇水平呈反向线性关系，而且Ⅱ，cs的黏附能力、迁移能力、增殖能力也明显受损。进一步的研究显示ox-LDL是高胆固醇血症患者内皮祖细胞数量功能改变的主要原因。本研究结果显示高胆固醇血症患者内皮祖细胞数量下降，功能受损，与国内外研究相似。高胆固醇血症(ox-LDL)导致EPCs数量减少和功能受损的确切机制尚不明确，目前认为可能与下列因素有关：(1)ox-LDL直接引起EPCs损伤；(2)ox-LDL增加EPC的凋亡；(3)ox-LDL影响EPCs的分化和动员。
内皮祖细胞是指出生后机体中存在的能特异性归巢于血管损伤、血管新生部位并分化成内皮细胞的一群干/祖细胞，参与体内血管内膜损伤的修复过程，在动脉粥样硬化早期预防中起重要作用。有学者发现冠心病病人循环中EPCs数量下降了近50％，迁移能力受损。因此，通过各种手段动员高胆固醇血症患者的EPCs，提高其外周血EPC8数量，保护高胆固醇血症患者的EPC8，恢复其功能，将大大降低高胆固醇血症患者动脉粥样硬化、冠心病的风险。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2009年1月至2011年12月在我院血液净化室89例长期维持 血液透析患者，男52例，女37例，年均21～79岁，平均年龄 53岁，原发性为慢性肾小球肾炎，高血压肾损害，糖尿病肾病，药物性肾损害，多囊肾等。
1.2 方法 常规血液透析结束后，拔去内瘘穿刺针，用无菌压迫条(由纱布折叠成的1.5×3×1 cm3大小的硬条)压迫穿刺针眼，松紧适当，30 min后逐渐放松，观察有无出血及血管损伤情况，每次于透析结束24 h后将新鲜生土豆切成比瘀血硬结范围宽1～2 cm,厚约0.5～1 cm大小的片状，用胶布或绷带固定土豆片，使土豆片紧贴皮肤，每3～4 h更换土豆片一次，每日3～4次，视治疗范围大小、所治疗时间不等。
1.3 穿刺血管及周围变化分型标准 透析结束穿刺针眼止血结束后，认真观察穿刺血管硬化及周围硬结情况。①无痛型：穿刺血管弹性好，无疼痛，无红肿，无硬结。②轻型：穿刺血管较硬，弹性降低，但无硬结。③中型：穿刺血管周围出现硬结，直径小于1 cm,有压痛。④重型：穿刺部位周围硬结直径大于1 cm，触痛明显。一般于实施护理措施3～7 d后观察判定结果。
1.4 观察疗效标准 痊愈：穿刺血管局部疼痛完全消失，周围硬结完全消失，血管弹性恢复；有效：穿刺部位疼痛明显缓解，血管变软，周围硬结开始变软或明显缩小；无效：症状如初，不见好转。
2 结果
显效81例，显效率91%，有效8例，有效率9%，总有效率100%。
3 讨论
维持性血液透析患者需要一条方便、耐用的血管通路，只有理想的血管通路才能保证有效的血液透析。临床上患者必须使用16 g穿刺针才能保证充分的血流量，由于长期反复的穿刺，对血管的破坏性极大，使用与保护不当会造成很多的并发性，影响动静脉内瘘的使用寿命。
土豆又名马铃薯、山药蛋等，主要成分为B族维生素、维生素C、胡萝卜素及茄定、茄碱、块茎葛苏等［2］。土豆中还含有龙葵碱，具有杀菌止痒，消炎消肿止痛等作用。因此在抑制炎症的过程中，可使毛细血管通透性增加，促进血液循环及皮肤新陈代谢。临床报道土豆治疗肌内注射引起的硬结、静脉输注各种药物引起的静脉炎症等均取得良好效果。
我院地处中原地区，经济欠发达，许多血液透析患者家处山区、农村，虽有新型农村合作医疗保险，但血液透析费用较高，再加上多年的求医问药，对每一位因家庭困难透析不充分，综合治疗跟不上的患者而言，经济负担恐怕是最根本的原因。土豆在我国种植面积较广，且价格低廉，透析患者使用土豆片治疗血管硬化及周围硬结对皮肤无刺激，安全有效，且取材方便，操作简单，无毒副作用，经济实用，患者更容易接受，值得临床借鉴推广。
参 考 文 献
【摘要】 目的 对亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1(elongation factor 1， EF-1)基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法 将亚洲牛带绦虫成虫EF-1克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，在大肠杆菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定，用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化，用蛋白印迹法(Western blotting)进行免疫学分析。结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-EF-1构建成功。重组蛋白可被感染了亚洲牛带绦虫患者血清和猪血清识别，表明其具有免疫反应性。结论 亚洲牛带绦虫成虫EF-1基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。
【关键词】 亚洲牛带绦虫；延伸因子-1；基因克隆；原核表达
ABSTRACT: Objective To clone and express the novel gene named elongation factor 1 (EF-1) of Taenia saginata asiatica in order to analyze the immunogenicity of the recombinant protein. Methods By screening the full length cDNA plasmid library， the coding region of EF-1 was amplified with PCR， and cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a(+) and then expressed in E.coli BL21 with IPTG induction. The recombinant protein was detected by SDS-PAGE and purified by Ni-IDA affinity chromatography， and its immunogenicity was analyzed by Western blotting. Results PCR， double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the recombinant expression plasmid was successfully constructed. Western blot analysis of EF-1 recombinant protein testified that the recombinant protein could be recognized by immunizing the serum of swine and patient， therefore indicating its immunogenicity. Conclusion A novel gene coding EF-1 of Taenia saginata asiatica was cloned and expressed successfully. The purified protein of EF-1 will be of importance for further research on the biological function of the gene.
KEY WORDS: Taenia saginata asiatica; elongation factor 1(EF-1); molecular cloning; prokaryotic expression
亚洲牛带绦虫(Taenia saginata asiatica)是近30年来发现的一种成虫形态与牛带绦虫相似，而囊尾蚴却与猪囊尾蚴相似并以猪作为中间宿主的人体带绦虫。2006年我们在前期研究的基础上进一步系统地开展对亚洲牛带绦虫在分类地位、分子诊断和疫苗等方面的研究［1-4］，为制定预防人体带绦虫病策略提供依据。本研究从亚洲牛带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出一个延伸因子-1(elongation factor 1， EF-1)的同源基因，构建了pET-28a(+)-EF-1原核表达载体，并对其原核表达产物进行了初步的免疫学研究，为进一步研究其生物学功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 血清来源
感染亚洲牛带绦虫猪血清由贵阳医学院寄生虫学教研室提供，患者血清采自亚洲牛带绦虫流行区贵州省都匀市米秀乡，健康人血清由中山大学热带病重点实验室提供。
1.1.2 文库、质粒、菌株
虫体标本采自亚洲牛带绦虫流行区贵州省都匀市米秀乡，亚洲牛带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建、EST测序及Unigene 分析与上海联合基因有限公司合作完成。原核表达质粒pET-28a(+)和大肠杆菌BL-21/DE3由中山医学院病原生物学实验室保存。
1.1.3 主要试剂和工具酶
Ex Taq酶(含dNTP)、EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA连接酶及DNA标准(DL2000)均购自大连宝生物工程公司；异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)购自美国Promega公司；Ni-IDA Agarose(cat No：69670)购自美国Novagen公司；蛋白分子量标准购自立陶宛MBI公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒购自北京赛百盛基因公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗、DAB(3，3二氨基联苯胺)显色试剂盒均购自武汉博士德有限公司；PVDF膜购自Millipore公司；TMB显色试剂盒购自美国BD公司；SDS、丙烯酰胺、亚甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、尿素等试剂均购自上海申友生物科技公司。
1.1.4 引物合成和DNA测序
基因扩增引物和重组质粒DNA测序由Invitrogen上海生物技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 EF-1基因的识别
将获得的亚洲牛带绦虫unigene进行Blastx分析，获得编码亚洲带绦虫成虫延伸因子-1基因文库质粒编号为T.a HC23-E9，GenBank登录号为EF420501的同源基因；并通过瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY， ca.expasy.org/)预测其理化特性。
1.2.2 EF-1基因的扩增 根据已获得的EF-1编码序列，利用DNAClub和PCRdesign设计引物。上游引物：CTAGAATTCATGGAGTGTGCGTTGAAGTTC，带EcoRⅠ酶切位点；下游引物：GGGCTCGAGTTACAATTTGTTGAAGGAAG，带XhoⅠ酶切位点。以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中EF-1基因的克隆质粒为模板，94 ℃预变性5 min后，热循环参数为94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳回收。
1.2.3 重组原核表达质粒［pET-28a(+)-EF-1］的构建及鉴定
将PCR产物和原核表达质粒pET-28a(+)经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后回收，连接、转化大肠杆菌BL-21/DE3感受态细胞，卡那霉素筛选阳性克隆。对阳性克隆提取质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定。
1.2.4 重组蛋白的表达
将确定能表达重组蛋白的单菌落接种于5 mL LB培养基中，过夜培养后1∶100转接到1 000 mL培养基中，培养至A600约为0.6时加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，28 ℃、250 r/min进行诱导。诱导4 h后离心收菌，用SDS-PAGE检测蛋白质的表达。
1.2.5 菌体的裂解、重组蛋白可溶性判断及待纯化融合蛋白上清的制备
取单菌落接种于1 000 mL含卡那霉素的LB培养基中，37 ℃震荡培养至A600为0.6时，加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L，28 ℃震荡培养4 h，4 ℃离心(6 000 g×10 min)，收集菌液，按文献［5］的方法，每克菌(湿重)加入3 mL裂解缓冲液，重悬细菌沉淀，裂解液冰上超声破碎(160 W，超声1 s，停2 s，超声5 min)，4 ℃ 13 000r/min离心20 min，收集上清和沉淀，分别取上清10 μL加入4×SDS上样缓冲液和沉淀微量加1×SDS上样缓冲液，煮沸5-10 min后行150 g/L SDS-PAGE判断重组蛋白的可溶性。
1.2.6 尿素变性纯化重组蛋白
在得到的包涵体(超声后沉淀)中加入A液10 mL重悬，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，弃上清，重复2次，再用B液洗涤1次，4 ℃ 6 000 r/min离心15 min。将洗涤后的包涵体沉淀加入8 mol/L尿素(溶于基础液)18 mL放置1 h左右，沉淀完全溶解，溶液清亮透明。采用透析法，逐步降低尿素浓度(8-6-5-4-3-2-1 mol/L PBS溶液)。
1.2.7 Western blotting检测重组蛋白的免疫反应性
将纯化的蛋白进行120 g/L SDS-PAGE电泳，使用电转移仪于100 V冰浴转印1.5 h，将蛋白转移至PVDF膜上，将含预染蛋白Marker条带剪下，PVDF膜转入感染亚洲牛带绦虫猪和患者血清中(1∶100稀释)，室温孵育2 h，PBS洗涤3次，每次5 min。然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪和抗人IgG(1∶2 000稀释)，室温孵育1 h，PBS洗涤3次，每次5 min，DAB显色至出现目的条带，超纯水终止反应［6］。
2 结 果
2.1 生物信息学分析
该基因与细粒棘球绦虫EF-1基因(登录号为AAF641192.1)的氨基酸序列的一致性达87%，相似性达91%；全长988 bp，编码区67-868，编码269个氨基酸。理论分子质量和等电点分别是28 067.8 u和4.88［7］。
2.2 原核重组质粒的鉴定
将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示在500-1 000 bp之间有一清晰的条带，与目的基因的大小基本相符，证明重组质粒构建成功(图1)。
2.3 蛋白表达纯化结果
将构建好的重组质粒转化到E.Coli BL-21/DE3中表达，SDS-PAGE电泳分析结果如图2中第4、5泳道所示，大约在34 ku左右处出现表达条带，与目的蛋白分子量基本相符。通过破包涵体，将蛋白进行纯化，结果如图2中第6、7泳道所示，其位置与目的蛋白相符，证明目的蛋白纯化成功。
2.4 Western blotting鉴定
感染亚洲牛带绦虫的猪血清以及感染亚洲牛带绦虫的患者血清对纯化蛋白的Western blotting均显示出清晰的条带(图3)。
3 讨论
研究表明，EF-1是一种在细胞内普遍存在且大量表达的多聚体核糖体蛋白质，在基因表达、翻译过程中起重要作用［8］。EF-1可能由α、β、γ、δ四个亚基组成，其中EF-1α属于G蛋白家族，它和氨酰tRNA、GTP一起组成复合体，通过正确地识别mRNA上的密码子和tRNA上的反密码子，负责转运氨酰tRNA 到80S核糖体，并具有低水平GTP酶的活性。EF-1β具有鸟苷酸交换活性，在EF-1α从核糖体离开并且构象由GDP形式变成GTP准备与新的AA-tRNA相互作用的过程中，需要EF-1β作为催化剂。EF-1γ常与EF-1β形成复合物，具有增加后者鸟苷酸交换的功能。至少在脊椎动物中，EF-1还有第四个亚基EF-1δ，尤其在其羧基端与EF-1β具有同源性，而在氨基端无同源性，表明它们可能具有不同的功能［9-10］。我们从亚洲牛带绦虫cDNA文库中识别出了一个EF-1的全长编码基因，其编码的氨基酸序列与GenBank中细粒棘球绦虫的EF-1基因 (登录号为AAF64192.1)的氨基酸序列的一致性达87%，相似性达91%，推测其为亚洲牛带绦虫EF-1基因，并且含有完整的开放阅读框，是一个全长cDNA序列。
通过生物信息学分析，该蛋白的理论分子质量为28 067.8 u，而质粒pET-28a(+)的载体标签序列的分子质量为6 ku，所以重组蛋白的分子质量大约应为34 ku。图2的4泳道显示的重组蛋白条带与预期的大小是一致的，并且条带很浓，但从该图的5泳道看出上清没有表达，说明该蛋白是以包涵体的形式表达，通过尿素变性纯化重组蛋白，得到了条带很浓的纯化蛋白(图2第7泳道)。本研究为包涵体蛋白的纯化积累了经验，同时还证实了重组蛋白在纯化后具有免疫反应性，获得了具有免疫活性的重组蛋白，为进一步研究其生物学功能以及在诊断尤其是疫苗研究方面的作用奠定了基础。
参考文献
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