摘要：目的探讨娃儿藤宁碱调节肝癌的生长及分子作用机制。方法采用MTT和平板克隆形成实验检测娃儿藤宁碱作用对细胞活力及单细胞增殖能力的影响;DAPI染色、Western印迹分析和流式细胞技术检测娃儿藤宁碱对肝癌细胞凋亡的影响;免疫荧光染色检测娃儿藤宁碱对细胞自噬的影响;应用自噬抑制剂(Bafilomycin A1)抑制自噬探究对凋亡的影响;应用细胞热转变分析实验(CETSA)和药物亲和力反应靶标稳定性测定(DARTS)实验分析娃儿藤宁碱与蛋白激酶B(Akt)之间的结合关系,采用分子对接模拟娃儿藤宁碱与Akt之间的作用位点,利用Western印迹实验对其进行验证;将两种肝癌细胞系HepG2和Hep3B的Akt进行过表达,应用Western印迹和免疫荧光染色实验分析娃儿藤宁碱对肝癌细胞的凋亡、自噬的影响。结果娃儿藤宁碱显著下调肝癌细胞生存活力,降低单细胞增殖能力;显著改变凋亡相关蛋白PARP、活化胱天蛋白酶3、Bcl-2和Bax,自噬相关蛋白P62和LC3B的表达水平。在娃儿藤宁碱作用下,细胞活力进一步下降,单细胞增殖能力进一步降低,细胞凋亡进一步增加。娃儿藤宁碱可减缓链金霉素或温度对Akt蛋白的降解速度,娃儿藤宁碱可以直接与Akt的C端结构域结合,并可以显著抑制Akt的磷酸化(S308位点活性),表达Akt后,娃儿藤宁碱抑制的细胞活力有一定程度的恢复,凋亡相关蛋白和自噬相关蛋白均有一定程度的逆转。结论娃儿藤宁碱通过促进肝癌细胞凋亡、诱导细胞自噬,进而发挥抗肝癌作用。

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