摘要：根据GenBank中Ⅰ型痢疾志贺菌ShT-A基因的核苷酸序列,设计合成了2对引物,分别进行PCR扩增,将PCR产物分别与pGEM-T连接构建了克隆质粒pGEM-TA1和pGEM-TA 2.用BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ以及BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pGEM-TA1和pGEM-TA 2,均得到大小为895 bp的ShT-A基因片段,分别与pQE30和pET21a(+)原核重组表达载体连接,构建pQE30-A2和pET-21A1原核重组表达质粒.工程菌M1 5/pQE30-A2和BL-21/pET-21A1经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,均没有目的蛋白表达.这表明全长ShT-A可能对E coli细胞产生毒性作用.DNAsis软件分析ShT-A基因序列,发现在513 bp处有HindⅢ位点,以ShT-A上游引物的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ从pGEM-TA1切出1个513 bp的截短片段,重新插入表达载体pQE30,经PCR和双酶切鉴定正确后,得到pQE30-A513重组表达质粒,转化E.coli M15经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,在20 000处出现1条特异性的表达蛋白带,与截短ShT-A513相对分子质量相符.经薄层扫描分析,该截短片段的表达量约占菌体总蛋白的37.4%,主要为包涵体形式.免疫印迹结果表明,表达的重组ShT-A513蛋白同抗ShT-A513鼠多抗有特异性结合.

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