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MERS冠状病毒3C样蛋白酶是一种新的细胞自噬诱导蛋白

解晴; 陈晓娟; 邢雅玲; 陈晓玲; 陈忠斌 安徽医科大学; 合肥230032; 军事医学科学院放射与辐射医学研究所; 北京100850
  • 中东呼吸综合征冠状病毒  
  • 3c样蛋白酶  
  • 细胞自噬  
  • 不完全自噬  

摘要:冠状病毒(Coronavirus,Co V)3C样蛋白酶(3CLpro)在冠状病毒复制过程中起重要作用,是一种重要的潜在抗病毒药物候选靶标。细胞自噬是宿主重要抗病毒防御机制之一,但目前冠状病毒诱导细胞自噬及其机制还不很清楚。本研究以人类新发高致病性冠状病毒——中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)为研究对象,探讨人类冠状病毒感染与细胞自噬的关系。通过免疫荧光法检测发现,MERS 3CLpro引起细胞内e GFP-LC3B绿色荧光点状聚集,同时MERS 3CLpro诱导自噬标志蛋白微管相关蛋白1-轻链3基(LC3-II)表达增多,表明MERS 3CLpro可激活细胞自噬。进一步研究发现,MERS 3CLpro诱导细胞自噬体形成而阻断或抑制自噬溶酶体形成,即MERS 3CLpro诱导不完全细胞自噬效应,而且MERS 3CLpro诱导细胞自噬具有时间依赖性且不依赖于其蛋白酶催化活性。此外发现SARS-Co V和NL63-Co V等其它人类冠状病毒3CLpro也具有诱导细胞自噬效应,表明3CLpro诱导细胞自噬可能是人类冠状病毒所具有的一种普遍生物学特性。本研究首次发现冠状病毒蛋白酶3CLpro能诱导宿主细胞自噬,是一种新型冠状病毒来源的宿主细胞自噬诱导蛋白,这一发现拓展了对人类冠状病毒蛋白酶功能的新认识,为研究冠状病毒与宿主抗病毒天然免疫以及以病毒蛋白酶为靶标的抗病毒药物研究提供了理论基础。

  • CRISPR相关的生物信息学基础

    作者:陶洋; 李金城; 廖奇 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第10期

    成簇规律间隔短回文序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得的一种适应性免疫防御机制,该结构与一些功能相关的蛋白质(CRISPR-associated,Cas)合称CRISPR-Cas系统。由于其致突变效率高、操作简单及成本较低的特点,近年来对CRISPR/Cas系统的研究获得越来越广泛的关注。该系统迅速在各领域中得到广泛应用,被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。但是,该系统存在脱靶效应、测序数据分析等挑战。为此,许多研究者开发出各种软件解决以上问题。本文着重从生物信息学的角度出发,对CRISPR/Cas系统中sgRNA的设计软件、CRISPR全基因组筛选功能基因的测序数据分析软件以及CRISPR在生物信息学中的运用作一系统综述。

  • 核雌激素受体配体结合域的晶体结构特性与功能

    作者:吴昕昊; 胥志祥; 潘学军 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第10期

    雌激素或类雌激素活性物质通过细胞核雌激素受体(nuclear estrogen receptor,n ER)通路发挥相应的生理性作用。当这些配体被n ER的配体结合域(ligand binding domain,LBD)识别后进入疏水性配体结合空腔内并引起受体构象发生改变,使得原先处于高度活动性的helix 12(H12)被固定从而进一步稳定空腔结构;同时n ER也能通过招募一系列辅助调节因子及其他共调节蛋白质,最终调控基因转录。但是,由于不同的配体和受体结合形成的晶体结构并不完全相同,导致这些复合体具有不同的性质,从而影响基因的转录活性。本文综述了n ER配体结合域及结合配体后形成的相应晶体结构与活性以及不同配体对受体结构和基因转录的影响。

  • 心磷脂重构与心血管疾病

    作者:何卓儒; 刘昌乐; 李坤平 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第10期

    心磷脂(cardiolipin,CL)是线粒体内膜的特征性磷脂,参与线粒体嵴的形成。心磷脂在线粒体内的合成伴随着特殊的分子重构过程,从而使其自身的4条酰基链形成特定的组成,以发挥其特殊的生理功能。研究发现,心磷脂重构对维持线粒体的形态及功能至关重要,其重构异常是大多数心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)共有的病理现象,相应的分子机制研究得到了广泛关注。本文主要对心磷脂的理化特性及其生物合成途径,以及心磷脂重构在巴氏综合征(Barth syndrome,BTHS)、糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)以及心力衰竭(heart failure,HF)等心血管疾病的病理生理过程研究中的进展进行综述,以期为与心磷脂重构相关的心血管疾病的病理生理基础研究和药物干预的分子机制研究提供参考。

  • 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂延长C.elegans寿命的作用机制

    作者:李娇; 崔晓东; 马晓丽; 王转花 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第10期

    重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(recombinant buckwheat trypsin inhibitor,r BTI)是一种来源于荞麦PotatoⅠ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,r BTI在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中具有很好的延长寿命的性质,但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明,r BTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性,进而影响线虫的寿命,且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术,分别对r BTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变,获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的r BTI突变体,分别命名为r BTI-R45A,r BTI-R45F,r BTI-W53R和r BTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示,野生型r BTI可以明显延长C.elegans的寿命,且在0-10μmol/L范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比,10μmol/L野生型r BTI延长寿命幅度可达到14.5%,但是突变体r BTI-R45 A,r BTI-R45 F和r BTI-W53 R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现,野生型r BTI可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致,4种r BTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中,r BTI可增强长寿因子DAF-16的转录活性,进而延长虫体寿命,且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发r BTI的功能提供了实验支持和理论基础。

  • MERS冠状病毒3C样蛋白酶是一种新的细胞自噬诱导蛋白

    作者:解晴; 陈晓娟; 邢雅玲; 陈晓玲; 陈忠斌 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第10期

    冠状病毒(Coronavirus,Co V)3C样蛋白酶(3CLpro)在冠状病毒复制过程中起重要作用,是一种重要的潜在抗病毒药物候选靶标。细胞自噬是宿主重要抗病毒防御机制之一,但目前冠状病毒诱导细胞自噬及其机制还不很清楚。本研究以人类新发高致病性冠状病毒——中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)为研究对象,探讨人类冠状病毒感染与细胞自噬的关系。通过免疫荧光法检测发现,MERS 3CLpro引起细胞内e GFP-LC3B绿色荧光点状聚集,同时MERS 3CLpro诱导自噬标志蛋白微管相关蛋白1-轻链3基(LC3-II)表达增多,表明MERS 3CLpro可激活细胞自噬。进一步研究发现,MERS 3CLpro诱导细胞自噬体形成而阻断或抑制自噬溶酶体形成,即MERS 3CLpro诱导不完全细胞自噬效应,而且MERS 3CLpro诱导细胞自噬具有时间依赖性且不依赖于其蛋白酶催化活性。此外发现SARS-Co V和NL63-Co V等其它人类冠状病毒3CLpro也具有诱导细胞自噬效应,表明3CLpro诱导细胞自噬可能是人类冠状病毒所具有的一种普遍生物学特性。本研究首次发现冠状病毒蛋白酶3CLpro能诱导宿主细胞自噬,是一种新型冠状病毒来源的宿主细胞自噬诱导蛋白,这一发现拓展了对人类冠状病毒蛋白酶功能的新认识,为研究冠状病毒与宿主抗病毒天然免疫以及以病毒蛋白酶为靶标的抗病毒药物研究提供了理论基础。

  • 血管紧张素1-7对氧糖剥夺/复氧的原代培养大白鼠海马神经元的保护作用

    作者:卞伟华; 陈明迎; 张小华; 许聪; 孙业盈; 杨玥; 杨美子 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第10期

    血管紧张素1-7(angiotensin 1-7,Ang1-7)在神经系统中发挥重要作用。已有研究发现,Ang1-7在脑缺血动物模型中发挥保护作用,但至今未见有关Ang1-7对氧糖剥夺/复氧(oxygenglucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤神经元的保护作用及其机制的研究报道。本研究以厌氧培养及不含葡萄糖的EBSS培养基培养、建立新生大白鼠原代培养的海马神经元OGD/R模型模拟脑缺血环境,实验分为3组:正常对照组、实验对照组和Ang1-7处理组。倒置显微镜观察神经元形态显示,Ang1-7处理组的神经元形态明显改善;CCK8试剂盒检测发现,Ang1-7处理组的细胞活性提高;流式细胞术研究发现,Ang1-7处理组的神经元凋亡和坏死率降低、神经元内Ca2+及NO水平降低;Western印迹结果发现,Ang1-7处理组Bax表达降低,Bcl-2表达增加。以上结果说明,Ang1-7可降低OGD/R神经元中NO和Ca2+水平,降低Bax蛋白、增加Bcl-2蛋白的表达,减少OGD/R神经元凋亡和坏死率,对OGD/R神经元发挥了保护作用。本研究为进一步在神经元水平上研究Ang-1-7的保护机制奠定基础,对中风等脑缺血疾病的防治具有重要意义。

  • CRISPR/Cas9介导的同源重组技术构建猪肌抑素基因敲除细胞系

    作者:綦世金; 华再东; 刘西梅; 华文君; 郑新民; 陈祥; 李太山; 陈建武; 李奎; 唐中林; 毕延震; 陈彬 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第10期

    肌抑素是肌肉增生的负调控因子,为改良家畜产肉性状的重要候选基因。本研究设计了Cas9/sgRNA表达载体与供体DNA,通过电转染方法将其导入猪PK15细胞,经G418抗性筛选和荧光蛋白标记甄别,筛选到带阳性标记的细胞克隆。通过跨界PCR、长距离PCR、Western印迹、Southern印迹及PCR产物测序,证明了猪肌抑素的第3外显子序列特异性同源重组事件的发生。在猪肌抑素的第3外显子区域找到了1个有效的CRISPR/Cas9打靶位点,带阳性标记的细胞克隆经过多次筛选分离,获得了肌抑素单等位基因失活的稳定细胞系,为深入研究肌抑素的功能提供了重要的实验材料。

  • 猪流行性腹泻病毒与宿主抗病毒天然免疫抑制

    作者:郭存财; 刘炎; 黄耀伟 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第09期

    猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)能引起猪腹泻等肠道疾病,属于α属冠状病毒,它的爆发给很多国家养猪业造成了严重的经济损失。2010年以来,PEDV感染在中国出现大规模爆发,一种突变型PEDV也于2013年在美国出现并迅速传播。RNA病毒能够通过Toll样受体通路3(TLR3)和RIG-I样受体通路(RLR)诱导I型干扰素的产生。但以往的研究表明,PEDV感染能抑制I型干扰素的合成。近年来有关PEDV调节宿主天然免疫应答的研究取得了很大进展。PEDV主要通过编码作为干扰素拮抗剂的病毒蛋白以及隐藏病毒自身病原相关分子模式(PAMP)等两种方式逃逸宿主天然免疫应答。目前已报道,PEDV非结构蛋白1可通过降解CBP阻碍干扰素调节因子3(IRF-3)组装成增强子复合体;木瓜蛋白酶样蛋白酶可通过其去泛素化酶活性阻断天然免疫信号通路传递;3C样蛋白酶可通过剪切NEMO发挥干扰素拮抗剂活性;核衣壳蛋白通过结合TBK1抑制I型干扰素产生。PEDV也可通过合成加帽酶隐藏其病原相关分子dsRNA来避免激活天然免疫通路。PEDV抗病毒天然免疫机制阐明为研究PEDV感染免疫和致病机制提供了重要的理论依据,为研发抗PEDV新型疫苗和药物提供了基础。

  • CDR1as与疾病的相关性

    作者:陈延慧; 郭建林; 徐存拴 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第09期

    环状RNA(circular RNA,circRNA)是存在于真核细胞中的一种非线性RNA,具有稳定性、特异性以及进化保守性等特征,通过发挥microRNA的海绵作用,对其靶基因进行调控。与线性RNA相比,环状RNA自身的闭合环状结构使其更具优越性。小脑变性相关蛋白1反义转录物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense,CDR1as)作为一种竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)间接调控miR-7靶标,通过多种途径影响多种疾病的发生和发展。本文就CDR1as的发现、来源及特征、功能以及与不同疾病的相关性作一概述。

  • Hedgehog信号通路与动物骨骼肌发育调控

    作者:夏博; 葛静; 史新娥 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第09期

    Hedgehog信号通路在动物胚胎期及出生后骨骼肌的生长发育过程中发挥着重要作用。本文综述了Hedgehog信号通路对骨骼肌细胞增殖分化及肌纤维特性的调控作用及其在骨骼肌发育过程中与其它信号通路交互作用最新研究进展,为畜禽肉品质改良和肌肉相关疾病治疗提供理论基础。

  • 大肠杆菌YacG锌指结构的金属结合及功能特性

    作者:杨娟娟; 章丽和; 苏晓璐; 卢彬彬; 纪松军; 黄招竹; 王伍 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第09期

    Yac G蛋白是一种能够抑制大肠杆菌促旋酶(E.coli gyrase)活性的内源性小分子蛋白质,仅由65个氨基酸残基组成。核磁共振(NMR)研究发现,Yac G结构中含有1个Cys-X2-Cys-X15-CysX3-Cys序列的锌指结构域,然而其作用并不清楚。本研究发现,在添加外源锌或者铁的M9基础培养基中,表达并纯化得到分别含有锌和铁的Yac G蛋白,而在同时添加铁和L-半胱氨酸的M9基础培养基中可以纯化得到含有铁硫簇的蛋白质。这表明,Yac G不仅是一个锌指蛋白,也是铁结合或铁硫簇结合蛋白。定点突变实验发现,Yac G锌指结构中的4个半胱氨酸残基突变后,其结合的锌、铁、铁硫簇的含量都显著下降。这提示,锌结合、铁结合以及铁硫簇结合的位点均位于锌指结构域中的4个半胱氨酸残基。体内Yac G过表达实验显示,用IPTG在大肠杆菌体内诱导表达野生型Yac G蛋白会导致其生长明显受到抑制,而过表达突变体蛋白(Yac G-C12/28S)对其生长的抑制作用将会减弱。体外实验进一步发现,锌结合、铁结合以及铁硫簇结合形式的Yac G蛋白对E.coli gyrase促DNA螺旋活性的抑制作用没有明显差别,但是锌指结构突变体蛋白(Yac G-C12/28S)对gyrase活性的抑制作用显著减弱。这说明,完整的锌指结构对Yac G抑制gyrase活性的功能具有重要作用。此研究有可能为gyrase抑制剂类抗生素药物的研发提供有用的线索。

  • 启动子荧光素酶报告系统检测低浓度过氧化氢激活神经肽PACAP特异受体PAC1-R启动子的作用

    作者:崔跃; 余榕捷; 彭星荷; 刘红玉; 郑丽君 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第09期

    垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)特异受体PAC1-R(PACAP receptor 1)是神经系统疾病药物开发的重要靶点。为了研究其表达的生物学机制,本研究克隆了PAC1-R基因转录起始位点上游从-2 500到+26的2 526 bp启动子片段,构建PAC1-R启动子驱动的荧光素酶基因报告载体p GL3-PAC1-Rp,并确证PAC1-R启动子荧光素酶报告系统在小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中工作正常。运用此PAC1-R启动子荧光素酶报告系统,首次发现低浓度过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)有效激活PAC1-R启动子,此作用可被转录因子特化蛋白1(specificity protein 1,SP1)抑制剂光神霉素A(mithramycin A)所抑制,提示SP1参与介导H2O2对PAC1-R启动子的激活作用。生物信息学分析显示,PAC1-R启动子含有多个SP1结合位点。PAC1-R启动子的荧光素酶报告系统的构建为深入探索PAC1-R高表达的作用与机制奠定了基础,低浓度H2O2对PAC1-R启动子激活作用的发现有助于深入诠释低浓度活性氧的生理学作用。

  • Lpa-miR-nov-66拮抗IGF1促羊驼黑色素细胞黑色素生成及细胞迁移作用

    作者:姬凯元; 胡帅鹏; 刘学贤; 刘彧; 杨姗姗; 张俊珍; 范瑞文; 董常生 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第09期

    胰岛素样生长因子1(IGF1)能够促进细胞迁移。我们最近的研究发现,一种新发现的miRNA(lpa-miR-nov-66)可通过靶向抑制可溶性腺苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase,s GC)抑制黑色素细胞产生黑色素。然而,当二者联合作用于黑色素细胞时,究竟如何影响黑色素细胞的黑色素产生及细胞迁移尚未见报道。本研究证明,lpa-miR-nov-66可拮抗IGF1的促黑色素细胞的黑色素生成及促细胞迁移作用。ELISA法检测结果揭示,与单纯IGF1处理比较,过表达lpa-miR-nov-66或过表达lpa-miR-nov-66联合IGF1处理可明显降低IGF1诱导羊驼黑色素细胞的c AMP生成水平。实时定量PCR和Western印迹证明,与单纯IGF1处理比较,过表达lpa-miR-nov-66或联合处理可明显降低毛色生成相关基因——MITF、TYR、和TYRP1在黑色素细胞的表达。此外,细胞增殖和细胞划痕实验显示,与单纯IGF1处理比较,过表达lpa-miR-nov-66或联合处理可显著抑制黑色素细胞的迁移。上述结果表明,lpa-miR-nov-66可以减少c AMP产生,抑制IGF1的促黑色素细胞产生黑色素的作用,并抑制IGF1对黑色素细胞增殖和迁移的促进作用。

  • CBX4与HOXA5在慢性粒细胞白血病中的表达及相互作用研究

    作者:熊凯; 薛丽香 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第09期

    Polycomb group complex(Pc G)作为发挥转录抑制作用的重要表观遗传调控复合物,参与发育、衰老以及肿瘤发生等重要病生理过程。Pc G成员众多,分为PRC1与PRC2两种复合物,各组分间功能既协同,又不失特性。PRC1中的CBX4独特的结构域使其功能尤为特殊。近年发现,作为一类造血干细胞恶性克隆性疾病,白血病中常伴有Pc G基因的异常表达或者突变。本研究通过q PCR发现,在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者外周血白细胞中存在CBX4的表达明显下调,而Pc G经典靶基因HOX家族中的HOXA5则表现为上调。给予伊马替尼(Imatinib)治疗后,二者均向相反方向恢复至正常人的表达水平,并且CBX4的表达水平与CML的经典分子标志物BCR-ABL1融合基因有较好的相关性。上述结果提示,CBX4可以作为CML潜在的预后标志物。为了进一步揭示CBX4与HOXA5是否存在相互作用关系,本文通过双荧光素酶实验证实,CBX4能通过HOXA5的启动子而负调控其表达。本研究发现,CBX4与HOXA5在CML中存在负相关的异常表达,且证明CBX4可作为HOXA5的负调控因子。

  • 单染色体靶向富集方法的建立

    作者:谢德健; 张田甜; 师明磊; 张彦; 沈文龙; 叶丙雨; 李平; 何超; 张香媛; 赵志虎 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2016年第09期

    靶向富集技术具有良好的均一性、特异性和灵敏性,只需较低的测序覆盖度即可满足后续的分析。该技术被广泛应用于特定位点重测序和染色体构象等研究。为了靶向富集测序文库中特定的染色体DNA片段,本研究以21号染色体为例,采用人胚肝二倍体细胞CCC-HEL-1建立了一种单染色体靶向富集方法。具体步骤如下:(1)首先将人正常核型二倍体细胞同步化到G2/M期,制备染色体悬液;然后流式分选出21号单染色体。(2)采用多重退火环形扩增技术(MALBAC)对21号染色体DNA进行扩增;用扩增的DNA产物构建文库。(3)利用体外转录合成、生物素标记的RNA探针与文库进行液相杂交,捕获并验证捕获效率。荧光定量PCR检测结果证明,特定的21号染色体呈上百倍的富集,而靶标文库则富集了近60倍。结果提示,特异单染色体靶向富集方法成功建立。该法不仅可实现任一单染色体的靶向富集,用于单条染色体功能组学研究,而且还可能用于查找特定疾病相关的染色体异常(如DNA突变、异位、重复及倒置等),具有一定的实用意义。

中国生物化学与分子生物学报

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