摘要：CRISPR/Cas技术能高效进行基因组定点编辑,但不同细菌来源或人工改造的Cas9以及Cpf1等核酸酶识别的PAM(protospacer adjacent motif)有差异,因此不同的基因编辑核酸酶可能采用不同类型的sgRNAs(small guide RNAs)。MicroRNAs(miRNAs)是一类调控性的小分子非编码RNAs,为了研究miRNA前体中是否可能存在特异性高的sgRNAs靶点,本文利用本课题组前期开发的生物信息学软件CRISPR-offinder,对靶向28 645条miRNA前体的11种不同类型sgRNA的丰度及特异性进行了分析,并利用CRISPR/Cas9慢病毒技术构建了猪miR-302/367基因簇敲除细胞系,对构建的猪miRNA敲除细胞系的效率进行了检测。结果表明,每个miRNA前体中平均存在约8种不同类型sgRNA的靶点;通过评估靶向猪miRNA前体sgRNA的脱靶效应,发现其中特异性高的sgRNA仅占18.2%;通过CRISPR/Cas9慢病毒技术成功构建了猪miR-302/367基因簇敲除细胞系,发现通过该技术构建miRNA敲除细胞系的效率为40%。本研究为利用CRISPR/Cas技术靶向敲除miRNA提供了重要资源。

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