摘要：目的构建以泛醌启动子(PUB)驱动绿色荧光蛋白(GFP)表达的慢病毒载体三质粒表达系统,并建立其包装细胞系获得GFP的表达.方法载体的构建采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法.三质粒系统中,转移质粒含PUB启动子及标志基因GFP,包装质粒为△NRF,内含CMV启动子和来自胰岛素基因的Poly(A)位点,包膜蛋白质粒编码水疱性口炎病毒G糖蛋白(VSV-G).载体构建成功后,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞--293T,12 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况.转染后72 h收集病毒上清,采用6孔板培养感染细胞,荧光显微镜计数GFP阳性细胞法测定病毒滴度.结果成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的质粒pXZ5.转染293T细胞后12 h在荧光显微镜下均观察到较强的绿色荧光,证实了GFP的表达,成功构建了慢病毒载体的三质粒系统,建立了慢病毒载体的包装细胞系.72 h后,GFP的荧光强度较12 h增强,每一视野下,GFP表达阳性的细胞比例达50%左右.病毒浓度的测定在未进行超速离心浓缩的情况下达2×108U/L.结论成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的的慢病毒载体三质粒表达系统,转染293T细胞后获得了GFP的表达,完成了慢病毒载体包装细胞系的建立.

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