摘要：目的通过靶向线粒体的氧化还原敏感绿色荧光蛋白探针（mt-roGFP2荧光探针）检测人肝癌HepG2细胞（以下称HepG2细胞）线粒体活性氧（ROS）水平动态变化,旨在为以线粒体ROS为靶标的肝癌化疗奠定基础。方法采用无缝克隆技术构建pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒载体并测序鉴定。将慢病毒载体pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK-puro与包装质粒pVSVg、pRev和pGag-Pol共转染人肾上皮293T细胞,获得mt-roGFP2慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将制备好的mt-roGFP2慢病毒颗粒感染HepG2细胞,通过荧光显微镜和Western blotting法鉴定观察HepG2细胞roGFP表达情况。将对数生长期稳定表达mt-roGFP2的HepG2细胞（HepG2-mtroGFP2细胞）与Mito Tracker线粒体荧光探针共温育,采用激光共聚焦显微镜观察mt-roGFP2荧光探针的亚细胞定位。取对数生长期HepG2-mt-roGFP2细胞先后经0.5 mmol/L过氧化氢（H2O2）和1 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）处理,采用尼康A1R激光扫描共聚焦显微镜拍摄同一细胞,Image J软件分析荧光图片。结果成功构建p LentiCMV-mt-roGFP2-PGK-puro慢病毒载体。制备的mt-roGFP2慢病毒平均滴度为4.04×10~8 IU/mL。mt-roGFP2荧光探针稳定表达在HepG2细胞中,并正确靶向HepG2细胞线粒体,成功构建HepG2-mt-roGFP2细胞。外源性氧化剂H2O2的加入可导致HepG2-mt-roGFP2细胞线粒体ROS水平明显升高,其荧光比值（405 nm/488 nm）从1.19上升到3.98,加入还原剂DTT可使其荧光比值下降至1.25。结论靶向线粒体的mt-roGFP2荧光探针能够实时动态、可逆地检测HepG2细胞线粒体ROS水平变化并实时成像。

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