作者:林贯川 期刊:《广东医科大学学报》 2012年第05期
目的构建hGPR177/PCDNA3.1(+)重组质粒,并在A549肺癌细胞中表达hGPR177蛋白。方法利用生物分析软件DNAMAN6.0选取合适的穿梭载体PCDNA3.1(+)和酶切位点。用质粒提取试剂盒对穿梭载体PCDNA3.1(+)及含有hGPR177基因pReceive-B04质粒进行抽提,并对其进行双酶切。使用DNA连接酶把hGPR177基因与PCDNA3.1(+)酶切片段连接,重新构建hGPR177/PCDNA3.1(+)重组质粒。将重组质粒通过电转的方式转导进A549肺癌细胞。运用细胞培养...
2006制药界前景黯然 世界制药巨头憧憬2007;瑞士研究显示来曲唑治疗乳腺癌优于他莫西芬;微生物农药将走俏市场 未来会取代化学农药;血友病克星表达凝血八因子新的重组质粒问世.
作者:曹学亮; 焦硕; 苏从成 期刊:《家畜生态学报》 2008年第03期
根据GenBank中报道的猪抑制素基因序列设计两对引物,克隆含有抑制素抗原决定簇基因片段α(1~32)的p1INH和p2INH,在这两个片段中都设有限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点,通过XbaⅠ把plINH与p2INH串联起来。串联抑制素基因片段与pcDNA3.1载体通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点连接后经过转化DH5a感受态细菌构建重组载体。以重组载体作为模板,以含有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点的引物进行PCR,产物经验证为含串联的抑制素基因。串联的抑制素...
作者:程小兵; 张虎生; 梁爱华 期刊:《图书情报导刊》 2005年第08期
近年来,随着生物工程技术的发展,人们已成功地将两种不同目的蛋白的基因构建于同一表达载体.这种双基因载体的构建克服了单一目的基因表达载体的不足,已在农业、医药和生物工程基础理论研究中得到广泛应用.
作者:周婷婷; 张景洲 期刊:《中国实验诊断学》 2019年第04期
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)是一种人畜共患的病原菌,主要引起败血症、肺炎、脑膜炎、心内膜炎及肠炎等细菌感染性疾病[1,2]。SA对环境的适应性较强,对临床应用的抗生素易产生耐药性[3]。在临床中可供选择的药物种类不多,通过基因水平分析其耐药性,寻找抗菌靶点将成为治疗SA引起特异性感染的一条重要途径。转肽酶A(Sortase A,SrtA)是金黄色葡萄球菌管家基因.
作者:王烈峰; 徐敏雯 期刊:《赣南师范大学学报》 2006年第03期
饱和苯酚氯仿法提取Tg2576转基因鼠基因组DNA,PCR法扩增编码β-淀粉样蛋白的目的基因,利用基因克隆技术构建以β-淀粉样蛋白为靶的表达载体pcDNA3.1-Aβ42×2,应用酶切及测序鉴定表达载体.相应的双酶酶切能够获得插入的目的基因片段(为269bp),测序未发现突变,表达载体构建成功.
作者:毛立军; 郑骏年; 李望; 郑宏祥; 刘俊杰; 孙晓青; 陈家存; 温儒民 期刊:《徐州医科大学学报》 2006年第01期
目的 构建端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体。方法 化学合成能编码针对hTERT基因的短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,退火处理后克隆到pSilencer1.0-U6 shRNA表达载体的U6RNA聚合酶Ⅲ(Pol Ⅲ)启动子的下游,构建重组RNAi质粒pSliencer-hTERT。结果 经酶切电泳及测序分析证实,目的序列成功插入到预计位点。结论 已成功构建pSliencer-hTERT载体,为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。
作者:孙延霞; 卢振霞; 卜丽莎; 杨绍娟; 高申; 王维忠 期刊:《中华血液学》 2005年第12期
RNA干扰(RNAi)是一种转录后的基因缄默.它能触发某种转录后监控程序,导致特定mRNA单链的降解[1-3].我们利用RNAi技术,针对survivin基因的2个不同部位设计2对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,用基因重组的方法将其置于质粒pGCsilencer的U6启动子下,构建pGCsi-lencer-survivin siRNA重组质粒,转导人白血病K562细胞,以阻抑survivin基因的过度表达,诱导K562细胞凋亡.期望为肿瘤的基因治疗提供实验基础.
作者:徐艳; 章锦才; 张蕴惠; 刘怡 期刊:《口腔疾病防治》 2004年第04期
目的检测以sIL-1R胞外成熟肽编码区基因作为目的基因构建的重组质粒pcDNA3/sIL-1R(Ⅰ)对人牙龈成纤维细胞的转染效率及瞬时表达量,为pcDNA3/sIL-1R(Ⅰ)导入动物牙龈组织提供依据.方法人牙龈成纤维细胞体外原代培养并传代,重组质粒用脂质体包裹介导进行体外转染.ELISA法对重组质粒在人牙龈成纤维细胞的表达产物进行含量检测.结果 sIL-1R(Ⅰ)在基因转染24 h内开始表达,72 h最高,转染组细胞培养液和细胞冻融液中sIL-1R表达量均显著高...
作者:苗小青; 王阳; 李淑华; 艾丽梅; 张佩 期刊:《中国全科医学》 2015年第20期
目的研究转染pcDNA-HA/ΔNp73α重组质粒对树突状细胞(DC)功能的影响。方法采取健康人脐带血,分离单个核细胞,置入含有白介素4(IL-4)和粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)的RPMI 1640完全培养基中培养。在培养第5、7天时收获DC细胞,加入FITC-anti-CD1a、PE-anti-CD83抗体,采用流式细胞仪检测CD1a、CD83表达情况。将DC分为正常培养至成熟的DC组(空白对照组)、空载体pcDNA-HA转染的DC组(阴性对照组)、ΔNp73α重组质粒转染的DC组(...
作者:韦相才; 卢丽; 黄冰; 韩俊英; 洪迅; 陈系古 期刊:《中国实验动物学报》 2005年第02期
目的探讨人地中海贫血β654基因为外源基因用于转基因小鼠制作时,外源基因的制备方法,为进一步制作转基因小鼠打下基础.方法采用反向点杂交法确诊人地中海贫血β654纯合子DNA,以PCR法扩增获得人地中海贫血β654基因,分离纯化后,通过连接酶反应将其克隆入含βLCR调控序列的基础载体pBGT51质粒中,经PCR扩增、酶切、反向点杂交及DNA测序鉴定重组质粒,用EcoR V酶切获得转基因所用的外源基因.结果将人地中海贫血β654基因作为外源基因克隆入...
作者:陈建君; 宋长绪; 杨增岐; 王贵平 期刊:《动物医学进展》 2005年第05期
根据测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株(PRRSV-GD)的序列,设计一对引物.用保存的PRRSV GD的 ORF5的克隆产物pMD-ORF5质粒作为模板,扩增ORF5基因.将该片段定向插入到原核表达载体pBAD/gⅢC中,转化大肠埃希菌.重组质粒经PCR和酶切鉴定后,用阿拉伯糖诱导表达.用Western blotting鉴定表达蛋白,证明ORF5基因得到表达.
作者:高长玲; 付宝权; 刘明远; 郭桓; 孙树民; 吴秀萍; 卢强; 陈启军; P.Boireau 期刊:《中国兽医学报》 2005年第03期
应用旋毛虫人工感染猪血清对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选,对阳性克隆WN1序列进行生物信息学分析.结果表明,WN1 cDNA全长为474 bp,含有1个354 bp的完整的开放阅读框架(ORF),编码的多肽由117个氨基酸残基组成,其相对分子质量理论推导值为13 200,等电点为4.25,N-末端的信号肽表明其可能为分泌性蛋白.GenBank数据库检索结果显示,此序列为一个新基因的全长cDNA.经PCR扩增WN1基因,将其克隆到原核表达载体pET28a,重组质粒经鉴定后...
作者:陈萍; 刘军; 祝令伟; 孙洋; 郭学军; 齐翀; 冯书章; 郑明光 期刊:《中国兽医学报》 2005年第03期
构建表达eae和stx1/2B的融合基因,克隆eae基因的C端280个氨基酸残基(Int280)基因部分,以正确地阅读框定向插入到含有stx1/2B融合基因的质粒,构建重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达.薄层扫描分析表明:目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的50.67%.由于该融合蛋白由eae、stx1B、stx2B等三部分抗原组成,可刺激机体产生针对紧密素和StxB的抗体,在E-HEC O157亚单位疫苗设计或单...
作者:赵爱珍; 韩文瑜; 徐兴然 期刊:《中国兽医学报》 2005年第03期
采用PCR技术从屎肠球菌的染色体DNA上扩增到1条529 bp的DN段entAIc,以pGEM-T为载体,将该基因片段克隆到大肠杆菌中,对阳性重组质粒pGAI测序.序列分析结果表明:片段entAIc含有2个ORF,Enterocin A结构基因entA和免疫基因entI,2个基因紧密相连.核苷酸序列分析显示,不同菌株来源的entA和entI具有较高的同源性,分别达到99.87%和99.76%.氨基酸序列分析显示不同菌株来源的Enterocin A前体完全相同,免疫蛋白仅有1个氨基酸差异.
作者:宁章勇; 赵德明; 杨建民; 崔亚利; 孟丽平; 吴长德; 秦秀慧; 马李颖 期刊:《中国兽医学报》 2005年第06期
对金黄地鼠PrP基因序列进行分析,选择其高度保守区域设计引物,对金黄地鼠各组织提取mRNA,经RTPCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行酶切、PCR和测序鉴定,表明PrP基因保守区段已经成功克隆.将107~102拷贝/反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,10次重复Ct值平均分别为17.50±0.5、21.38±0.2、25.29±0.7、29.12±0.7、31.34±0.4、33.89±0.1,系统自动分析软件显示Ct值...
作者:张倩倩; 刘康泰; 韩宗晟; 李荣贵 期刊:《生物技术通报》 2018年第10期
人工合成了大小为2 253 bp刺突蛋白的S1亚基的基因片段,构建了含有中东呼吸综合征冠状病毒刺突蛋白S1亚单位(MERS-Co V S1)编码基因的重组表达质粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc,转染重组质粒至HEK293E细胞后,筛选出了可稳定表达重组融合蛋白的阳性克隆细胞株,进行了刺突蛋白亚单位融合蛋白(S1-Fc)的重组表达和纯化,获得了大小约为122 kD的重组S1-Fc融合蛋白,Western blotting验证重组蛋白为目的蛋白;将重组质粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc、重...
作者:金宁一; 秦晓冰; 郑敏; 鲁会军; 张洪勇; 尹革芬; 葛淑敏 期刊:《中国生物工程》 2005年第07期
为了筛选得到较理想的核酸疫苗,用pVAX1真核表达载体,以猪白介素18基因、猪2型圆环病毒内蒙株的衣壳蛋白和与复制相关蛋白基因为目的基因,构建了4个重组质粒,分别是pVAX1-ORF2、pVAX1-IL18ORF2、pVAX1-ORF2ORF1和pVAX1-IL18ORF2ORF1.用它们免疫6~8周龄Balb/c小鼠,进小鼠后一周首免,每隔19d免1次,共免3次;每10d采血1次,三免后10d杀鼠取脾.用ELISA方法检测小鼠血清抗体效价,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类CD4+、CD8+数量.统计学分析...
作者:刘家森; 陈淑红; 刘怀然; 孟庆文; 庞海; 孔宪刚 期刊:《中国生物工程》 2005年第09期
以SARS冠状病毒(BJ01株)基因组RNA为模板,经RT-PCR扩增得到SARS-CoV nsp8基因,并克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pNSP8E.pNSP8E转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达出可溶性的GST-nsp8融合蛋白,经亲和层析和自剪切获得了高纯度nsp8蛋白.以nsp8为抗原免疫家兔,制备了nsp8的多克隆抗体,为下一步研究其在病毒感染的细胞中的功能奠定了基础.
作者:杨泽华; 解军; 杨琦; 张悦红; 牛勃 期刊:《中国生物工程》 2005年第08期
为了建立人脂联素球状结构域(gAd)原核高效表达体系,分离纯化gAd并检测其生物活性,从淋巴细胞中提取人基因组DNA,PCR扩增出含有脂联素编码序列的片段,通过T-A克隆的方法克隆入pMD18-T载体中,然后设计适当的引物引入起始密码、终止密码以及相应的酶切位点,把脂联素球状结构域(gAd)基因亚克隆到表达载体pBV220,将序列鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中,用42℃温控诱导目的蛋白的表达;超声破菌,分离纯化包涵体,8mol/L尿素溶解,...