作者:王钦; 李建林; 唐永凯; 李红霞; 张磊; 沈泽恩; 俞菊华 期刊:《南京农业大学学报》 2020年第02期
作者:钟杰; 佟硕秋; 贡献; 林宗梅; 孙元烽; 张问平; 郑娟; 吴拥军 期刊:《分子植物育种》 2019年第21期
CAF1基因在植物的发育和抗逆性方面起到特定的作用。本研究旨在通过对烟草中CAF1基因进行克隆与原核表达分析,为研究其代谢机制提供数据支持。我们从野生烟草中提取总RNA,通过RT-PCR克隆获得CAF1的cDNA序列,NCBI登录号为KJ003855,生物信息学分析表明,CAF1 ORF长为855 bp,编码285个氨基酸,亚细胞定位于细胞核,其编码的CAF1蛋白仅有1个高度保守结构域:CAF1 superfamily(16~284);构建p ET30a-CAF1原核表达载体,转化到E.coli BL21(DE3)...
作者:苏旭; 张永军; 耿亭; 李静; 谷少华 期刊:《昆虫学报》 2019年第12期
【目的】本研究旨在解析小地老虎Agrotis ipsilon化学感受蛋白AipsCSP8的表达谱及配体结合特征。【方法】利用qRT-PCR方法测定了AipsCSP8在小地老虎成虫头、胸、腹、足、翅、性腺(附腺)、触角、喙和下唇须以及雌雄虫羽化前后触角中的表达水平。体外重组表达AipsCSP8蛋白,通过荧光竞争结合实验测定重组蛋白AipsCSP8对24种性信息素、22种植物挥发物和10种化学农药的结合特性。【结果】qRT-PCR检测结果显示,AipsCSP8在小地老虎雄成虫...
作者:王卫东; 齐建国; 谷淑燕 期刊:《湖北师范大学学报·哲学社会科学版》 2005年第01期
EB病毒核抗原1羧基端的原核表达产物以包涵体和可溶性两种形式存在,用镍离子亲和柱分别对其进行了纯化.结果显示,可溶性部分以及经2M尿素溶解后的包涵体的最适咪唑洗脱浓度均为150mM.纯化后重组蛋白的纯度在90%以上.
作者:兰泓; 孔劭凡; 李慎涛; 张玉祥 期刊:《生物资源》 2015年第04期
通过限制性内切酶克隆法构建两个pET-28a-TAT-RNaseH-Apaf1重组质粒,其中一个质粒经过稀有密码子的优化。将两个重组质粒分别转化原核表达宿主菌BL21(DE3)和Transetta(DE3),通过SDS-PAGE观察相应融合蛋白诱导表达的情况,并用His标签抗体和Apaf1抗体通过Western Blotting鉴定诱导蛋白。菌液PCR和测序证明经稀有密码子优化和未经稀有密码子优化的人源RNaseH-Apaf1序列成功重组到pET-28a-TAT载体中;经稀有密码子优化的重组质粒成功地...
作者:杨礼香; 王正询; 柯德森; 巫锦雄 期刊:《生物资源》 2009年第04期
拟南芥的血红蛋白1(AtGLB1)属于非共生的血红蛋白。在低氧胁迫中对植物细胞中过氧化氢(H2O2)内稳态的维持起了很重要的作用。为了检测AtGLB1与H2O2能否直接相互作用,我们扩增了拟南芥的AtGLB1基因,并将其克隆到原核表达质粒pET32a中,测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导目的蛋白表达后,镍离子亲和层析柱(Ni^2+-NTA)纯化了靶蛋白。体外表达的氧台的AtGLB1能与H2O2直接相互作用。因此,与H2O2反应可能是AtGLB1清除...
作者:张星亮; 谭建新 期刊:《广东医科大学学报》 2015年第04期
目的获得外源表达的可溶性β-Ogg1和H-Ras蛋白并鉴定其相互作用。方法将β-Ogg1、H-Ras基因构建到含有GST标签的p GEx-4T-2-TEV和6*His标签的p ET-28a-TEV原核表达载体上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)。采用SDSPAGE检测表达产物,GST介导的Pulldown方法鉴定蛋白相互作用。结果成功构建了β-Ogg1和H-Ras基因原核表达载体并转化大肠杆菌。在8-oxo G小分子作用下,β-Ogg1与H-Ras有直接相互作用。结论采用原核表达和亲和层析纯化得到可溶性GS...
作者:吴秀萍; 陆佳; 张亮; 李敏; 朱曼玲; 张旺东; 何晚红; 李建飞; 王雯慧 期刊:《动物医学进展》 2019年第12期
为制备抗双峰驼IgA的抗体,将双峰驼IgA重链恒定区基因克隆至pET-28a(+)上,构建重组蛋白质粒pET-28a-IgA-H,再进行IPTG诱导表达、分析和纯化,以及SDS-PAGE和Western blot验证。用以获得的目的蛋白制备兔抗双峰驼IgA多克隆抗体,并通过ELISA和Western blot检测效价及其特异性。结果表明,获得的重组目的蛋白大小约为39 ku,最佳诱导表达条件为IPTG 23.83μg/mL、诱导时间6 h,且重组蛋白主要以包涵体的形式表达。ELISA检测显示抗体效价达1...
作者:秦飞燕; 孙杰; 马凡舒; 王洋; 柏玲; 张蕾; 闫喜军 期刊:《中国兽医学报》 2019年第11期
为探究水貂阿留申病毒(ADV)VP2主要抗原表位在水貂阿留申病血清学诊断中的作用,本试验将VP2蛋白主要抗原区的表位基因用柔性肽串联连接,将其克隆到表达载体pET-30a(+)中进行原核表达,并对诱导条件进行优化。利用Ni-NTA His-Bind纯化系统对融合蛋白进行纯化,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物,并将融合蛋白作为检测抗原进行CIEP试验。结果显示,融合蛋白在IPTG终浓度为1mmol/L、37℃诱导表达4h,蛋白表达量最高,其大小约为30000,...
作者:魏鑫; 张建华; 郭婷; 吕天星; 周雅坪; 张新竹; 吴倩; 陈新迪; 王艳芳; 白帆; 郝永清 期刊:《中国兽医学报》 2019年第11期
利用生物学软件分析牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白的抗原决定簇,发现相应的核酸序列,设计特异性引物用PCR扩增IBRVgD基因片段并克隆到原核表达载体pET-32a中,通过双酶切鉴定正确和测序正确后进行诱导表达。利用间接ELISA方法和Western blot鉴定gD重组蛋白的免疫原性和反应原性。最后将gD重组蛋白用作包被抗原,并通过优化相应的反应条件建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法。结果显示,表达的gD重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原...
作者:侯朔; 高燕会; 童再康 期刊:《农业生物技术学报》 2019年第12期
作者:王璇; 吴玙彤; 潘淑惠; 黄波; 高明琴; 文正常 期刊:《中国动物传染病学报》 2020年第01期
本研究以贵州羊传染性胸膜肺炎支原体分离株(GM01株)基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增目的基因RPS11,并克隆到pET28a(+)载体,成功构建了重组质粒pET28a-RPS11,将其转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中诱导表达重组RPS11蛋白并建立了羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测方法。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量为19 kDa,纯度为85%,具有良好的抗原性及特异性;检测方法经条件优化,确定了抗原包被浓度为1μg/mL,血清稀释度为1∶400,酶标二抗工...
作者:戴建华; 张彤宇; 孙逊; 刘博; 王永娟 期刊:《中国动物传染病学报》 2020年第01期
为开展番鸭源呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)σC基因编码蛋白的相关研究,本研究采用RT-PCR技术从MDRV全基因组中扩增σC基因片段,与p ET24a载体连接,构建原核表达重组质粒p ET24a-C,转化BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达σC重组蛋白;并利用SDS-PAGE电泳和Western blot检测其表达情况和免疫原性。结果显示,扩增的σC基因序列与Gen Bank所发表的序列同源性为100%;σC重组蛋白能在大肠杆菌中大量表达,其分子量约为30 kDa,且能...
作者:梁卫红; 唐朝荣; 吴乃虎 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2004年第06期
以Rho家族成员OsRacD为诱饵,采用酵母双杂交体系,分离到两种与OsRacD互作的水稻Rho GDP解离抑制蛋白的基因,分别命名为OsRhoGDI1和OsRhoGDI2,酵母体内结合和GST pull down分析结果显示,OsRhoGDI1和OsRhoGDI2与野生型和组成型激活的OsRacD都能结合,且不依赖GDI的N端部分序列;GDI和Rho的结合具有一定的特异性,两种GDI在水稻根、地上组织和幼穗等多种组织和器官都有表达,但在表达特征上存在明显差异.研究证实,在水稻中存在...
作者:尚玉磊; 张炳欣; 王琦; 梅汝鸿 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2004年第06期
采用PCR技术,从蜡样芽胞杆菌M22基因组DNA扩增到长1320bp的基因片段.该片段含编码179个氨基酸残基的开放阅读框,推定蛋白序列与报道的Bacif2淞anthracis Cu,Zn—SOD序列有96%同源性,其中N端16个氨基酸残基推定为信号肽序列.将Cu,Zn—SOD编码区插入载体pET-22b(+)构建表达载体pET-22b-sodC,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,SDS—PAGE显示,融合蛋白表观分子质量约24kD,占菌体裂解液中总蛋白的21.3%.将此...
作者:刘爽; 田媛; 胡宝成; 黎舒佳 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2005年第02期
为进一步了解Hus1蛋白在细胞周期检查点信号传导通路中的功能,用RT-PCR技术从NIH3T3细胞的总RNA中扩增出Hus1基因片段Hus1f(606~846 bp),使其在大肠杆菌中呈可溶性表达.用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化Hus1f蛋白,获得纯度较高的蛋白.用纯蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.ELISA结果显示效价达到1:6400.Western印迹结果表明,该抗体可以与Hus1蛋白特异结合.通过免疫共沉淀实验发现,Hus1蛋白与Chk1蛋白之间存在相互作用,为进行信号转导通路的...
作者:麻莉; 刘友生; 王晓东; 李永旺 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2004年第04期
重组人内毒素结合肽(endotoxin binding peptide,EBP)融合蛋白在大肠杆菌中表达,分离和纯化后对其进行生物学活性观察.将构建好的Pinpoint Xa3-EBP生物素融合表达载体转化大肠杆菌DI-I5α,IPTG诱导表达菌株,亲和层析法纯化表达产物,因子Xa(factor Xa)切割分离内毒素结合肽,采用凝胶过滤和反相液相高效色谱法两步纯化,从相对分子质量、N端10个氨基酸的序列分析等方面进行鉴定;利用人单核细胞U937对重组内毒素结合肽进行了生...
作者:汪自然; 常文娇; 戴媛媛; 马筱玲 期刊:《安徽医科大学学报》 2019年第12期
目的构建LukS-PV与GFP融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达纯化并鉴定。方法煮沸法提取金黄色葡萄球菌铜23的DNA作为模板,PCR扩增得到LukS-PV基因产物,经胶回收后与pMDN8T质粒连接过夜后转化至感受态菌DH5$中。提取质粒经PCR、测序鉴定无误,双酶切后连接到peW8a和6HTFP载体上,先转化至感受态菌DH5$再转化到BL21宿主菌中。对LukS-PV-GFP表达产物使用SDS-PAGE电泳分析,并取诱导前和IPTG诱导5 h菌液涂片置于荧光显微镜下观察。使用West...
作者:李恩广; 郭宝太; 杨雪; 朱虹; 王晶珊; 乔利仙; 隋炯明 期刊:《青岛农业大学学报·自然科学版》 2019年第04期
由褪绿矮化病毒(SPCSV)和羽状斑驳病毒(SPFMV)协生共侵染引起病毒病(SPVD)是甘薯最严重的病害之一。为了建立一种高效的甘薯病毒病SPVD检测体系,本研究构建了SPCSV和SPFMV重组双CP基因的原核表达载体pET22b-SPVD-CP,该重组菌在20℃条件下经IPTG诱导,获得了68 kDa的融合蛋白(重组双CP)。利用高纯度重组双CP为抗原免疫家兔,获得了SPVD的抗血清,间接ELISA检测显示抗体稀释度在1∶512 K的范围内,制备的抗体与抗原具有较强的结合活性。...
作者:连凯琪; 周玲玲; 张明亮; 张慢; 王英杰; 林正丹; 宋玉伟 期刊:《河南农业科学》 2020年第01期
为了开发塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)的检测试剂盒,克隆3 ABC基因进行原核表达和纯化,并将纯化的3ABC蛋白免疫大鼠,制备抗3ABC蛋白的多克隆抗体。通过Western blot鉴定制备的多克隆抗体与表达的3ABC蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,3 ABC基因在大肠杆菌中大量表达,且主要以包涵体形式表达,重组蛋白分子质量约为55 ku,经纯化后得到单一条带。免疫大鼠制备的多克隆抗体效价大于1∶64000,且...