作者:李慧; 郑馥荔; 王晓兰 期刊:《生物学通报》 2014年第07期
位于人类21号染色体唐氏综合征关键区(DSCR)的TTC3基因所表达的蛋白TTC3具有泛素连接酶的活性。其表达异常可能会影响其他蛋白的泛素化水平和降解速率,并可能与唐氏综合征表型发生相关。在前期研究中发现TTC3蛋白在细胞中过表达易形成聚集体。为了在细胞内观察TTC3蛋白的聚集过程,以及该过程对细胞的毒性影响,采用T—REx系统进行TTC3基因稳定转染细胞株的筛选,得到了能够通过四环素诱导蛋白稳定表达的细胞株.解决了瞬时转染...
作者:李姿其; 衣龙达; 米梓萌; 于卓; 周沫含; 王继红; 肖蓉 期刊:《水产科学》 2019年第06期
rLj-RGD3是一种含有3个RGD模体的七鳃鳗毒素蛋白,具有抗血栓和抗肿瘤功能。为研究3个RGD模体与其蛋白功能的关系,rLj-RGD3系列突变体的获得成为关键。rLj-115是第Ⅰ及第Ⅱ位RGD缺失、第Ⅲ位RGD保留的突变体,本研究针对其进行了基因克隆、蛋白表达及纯化。由于rLj-RGD3基因具有大量重复序列,突变体基因无法通过定点突变方法获得,故对该突变体基因进行人工合成及PCR扩增、NdeⅠ和HindⅢ双酶切,并构建于pET23b质粒。DNA测序结果显示,...
作者:李浩杰; 杨雪珍; 蓝文康; 张伟崇; 王晔; 何兰花; 林树茂; 刘燊; 张辉华 期刊:《家畜生态学报》 2019年第10期
为了构建一种胞内表达人溶菌酶(hLZ)的毕赤酵母工程菌,此研究以人工合成人溶菌酶基因序列,通过酶切位点插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,获得pPICZαA-hLZ。线性化该表达载体,电转化并筛选阳性克隆,甲醇诱导重组蛋白表达后,进行纯化和活性分析。结果表明,通过亲和层析树脂(Ni-IDA)从培养液上清纯化目标蛋白,SDS-PAGE表明目标蛋白为14.7kDa左右,Western-blot结果表明目标蛋白即为带有6个His标签的重组人溶菌酶,BCA法测定表明纯化后的蛋...
作者:张园; 王文骞; 宋雨心; 王婷婷; 刘琳琳; 崔红玉; 何高明 期刊:《中国家禽》 2019年第05期
为提高重组乳酸菌NICE诱导表达系统表达外源蛋白的能力,研究选取Nisin加入量、OD值、诱导温度和诱导时间这4个主要影响表达的因素,每个因素设置3个水平,设计4因素3水平(43)正交试验。通过优化Nisin加入量、OD值、诱导温度和诱导时间,从而确定重组乳酸菌表达外源蛋白最佳条件。结果显示:当Nisin的量为1 ng/mL、OD值为0.3、诱导温度为30℃、诱导时间为7 h时,其重组乳酸菌表达外源蛋白的量最高。研究结果为由Nisin控制表达基因系统的...
作者:张雷; 卫广森 期刊:《中国兽药》 2005年第05期
将猪传染性胃肠炎病毒的N基因克隆到表达载体pET28a后,转化到BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中.通过筛选表达温度和IPTG的浓度,使N基因在原核表达系统中表达并使目的表达产物产量达到最高值.将诱导表达的产物进行SDS-PAGE蛋白电泳和Western检验,证明该表达产物是猪传染性胃肠炎病毒的N蛋白.试验结果说明,猪传染性胃肠炎病毒N基因能够在原核表达系统中大量表达,而且表达的蛋白质具有生物学活性.
作者:陈建君; 宋长绪; 杨增岐; 王贵平 期刊:《动物医学进展》 2005年第05期
根据测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株(PRRSV-GD)的序列,设计一对引物.用保存的PRRSV GD的 ORF5的克隆产物pMD-ORF5质粒作为模板,扩增ORF5基因.将该片段定向插入到原核表达载体pBAD/gⅢC中,转化大肠埃希菌.重组质粒经PCR和酶切鉴定后,用阿拉伯糖诱导表达.用Western blotting鉴定表达蛋白,证明ORF5基因得到表达.
作者:孙丽翠; 刘朋朋; 杨国庆; 仲飞; 刘维全; 齐顺章 期刊:《中国兽医学报》 2004年第04期
采用胶原酶分阶段消化法对家兔的原代乳腺上皮细胞进行了分离培养,并且构建了以牛β-乳球蛋白(BLG)基因5′调控序列为启动子、以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因的真核表达载体.将该载体转染兔原代乳腺上皮细胞,然后用不同质量浓度的皮质醇、胰岛素和催乳素诱导.结果表明,用5 mg/L催乳素+5 mg/L胰岛素+1 mg/L皮质醇诱导,在诱导36 h后开始有荧光出现,诱导48~60 h时荧光更强一些,而未经诱导的细胞GFP则不表达.
作者:陈萍; 刘军; 祝令伟; 孙洋; 郭学军; 齐翀; 冯书章; 郑明光 期刊:《中国兽医学报》 2005年第03期
构建表达eae和stx1/2B的融合基因,克隆eae基因的C端280个氨基酸残基(Int280)基因部分,以正确地阅读框定向插入到含有stx1/2B融合基因的质粒,构建重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达.薄层扫描分析表明:目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的50.67%.由于该融合蛋白由eae、stx1B、stx2B等三部分抗原组成,可刺激机体产生针对紧密素和StxB的抗体,在E-HEC O157亚单位疫苗设计或单...
作者:席慧; 刘凤华; 周霞; 徐燕; 李永海; 高音 期刊:《生物技术通报》 2004年第03期
核糖核酸酶HII(RNage HII)能有效降解RNA和DNA杂交链中的RNA链.为进一步研究其功能,利用大肠杆菌XLlblue为模板,相应的寡聚脱氧核苷酸为引物,PCR扩增大肠杆菌RNase HII(rnh 2)基因,并将目的基因连接到克隆载体pUC18上,经测序确认无误,分别亚克隆到能够进行IPTG诱导的表达栽体pTrcHisC和进行温度诱导的表达载体pBV220上.重组质粒转化到大肠杆菌DH5α细胞中获得高效表达.在载体pTrcHis和pBV220中目的蛋白RNase HII的表达量均超过菌体...
作者:张怀; 袁其朋; 朱亚平; 马润宇 期刊:《中国生物工程》 2005年第03期
为了在大肠杆菌中表达生产hepcidin,根据大肠杆菌密码子偏好性,化学合成了人hepcidin的基因序列,并构建了hepcidin的融合表达载体pET-hpc.pET-hpc在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的hepcidin融合蛋白以包涵体形式存在,其N端带有6个组氨酸.通过优化诱导表达条件,该融合蛋白表达水平显著提高,占总蛋白的25.2%.表达的包涵体经1%Triton X-100洗涤后溶于8mol/L尿素,在变性条件下采用金属螯合层析进行纯化,所得融合蛋白纯度大于95%.
作者:梁东春; 左爱军; 王宝利; 郭刚; 张镜宇 期刊:《中国生物工程》 2005年第07期
以重组质粒pUC-BMP2为模板PCR扩增人BMP-2成熟肽编码序列,将该序列克隆入pGEM-T载体进行DNA序列分析后亚克隆入分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9K中.重组质粒pPIC9K-BMP2经BglⅡ酶切后回收线性化片段,聚乙二醇法转染毕赤酵母菌株GS115.PCR筛选整合有人BMP-2基因的酵母细胞重组子,以甲醇进行诱导表达,于酵母细胞培养基中可检测到rhBMP-2.体外培养条件下,所得rhBMP-2可增加2T3小鼠成骨细胞内碱性磷酸酶活性;体内实验,rhBMP-2冻干粉可于小...
作者:吴雪峰; 赵开军; 陈毓荃 期刊:《中国生物工程》 2004年第12期
启动子是位于基因5′端并负责该基因转录的DNA序列.诱导性启动子中有一些对伤害、真菌侵染、紫外线照射、激素等做出应答反应的顺式作用元件,被称为模序.已在植物启动子中鉴定出许多与诱导表达相关的模序,如伤害诱导模序,真菌诱导模序,植物激素诱导模序和光诱导模序等.这些模序作为启动子的顺式元件对各种诱导因子做出反应、调控基因的表达.
作者:郁建锋; 张芸; 王中亮; 李洁; 张燕萍; 龚道清; 顾志良 期刊:《农业生物技术学报》 2018年第03期
肝细胞核因子1α (hepatocyte nuclear factor 1α, HNF1α)调控众多的肝脏特异性基因,参与机体的脂类、糖类和蛋白质的代谢过程。以PCR技术从本研究室已构建的真核表达载体pcDNA3.1-HNF1α质粒上扩增获得鸡(Gallus gallus) HNF1α的编码序列,在其5′、3′端分别引入的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,以此位点将其克隆入pET30a表达载体,并构建获得重组表达菌BL21-pET30a-HNF1α。然后以不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (isopropyl-β-D...
作者:何国庆; 李春丽; 阮晖; 陈其新; 陈正华 期刊:《农业生物技术学报》 2005年第02期
根据人β-防御素-3(hBD3)和植物甜蛋白Brazzein(Bra)的成熟区氨基酸序列,按照细菌密码子的偏爱人工合成了7对末端具粘合位点的核苷酸序列.经连接和PCR扩增,使人β-防御素-3与植物甜蛋白Brazzein的编码序列通过一段序列(含凝血酶切割位点)连接成为嵌合DNA.将其插入到pET30a的T7启动子之下,构建成了防御素和甜蛋白双价基因的表达载体pET30a-hBD3-Bra,在大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中诱导表达后,得到了与预计分子量相同的蛋白,约占总...
作者:杨志新; 周晓巍; 朱恒奇; 徐秀英; 黄培堂 期刊:《生物技术通讯》 2004年第05期
利用PCR技术从含有IL-1ra的质粒上扩增IL-1ra基因,经过序列测定后插入表达载体pTIG-Trx,并转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达.经SDS-PAGE分析显示,IL-1ra表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达产物出现相对分子量大约为17 000的一条新生蛋白质带,其大小与预期结果一致,经Westem和ELISA分析,证明该带即为目的蛋白,SDS-PAGE显示目的蛋白全部以可溶性蛋白的形式存在.超声破碎后,上清经金属螯和层析纯化获得纯度约为98%的蛋白样品.
作者:陈群英; 陈国安; 薛彬; 张显久; 殷志敏 期刊:《生物工程学报》 2004年第03期
通过PCR方法从Bacillus subtilis基因组DNA中扩增出谷氨酰胺合成酶基因(glnA),克隆至表达载体pET28b,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG及乳糖诱导表达.SDS-PAGE分析表明,所表达的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,简称GS)为可溶性蛋白,约占总菌蛋白的80%.利用表达的GS蛋白N端的6×His-Tag对GS进行亲和层析,将获得的纯蛋白进行酶活性测定.结果表明,纯化的GS合成反应的最适温度为60℃,最适pH为6.5,Mn2+能明显提高GS的活...
作者:薛丽君; 金中初; 夏小俊; 陈维亚; 李红娟; 薛旦; 梅汝焕 期刊:《毒理学》 2005年第02期
目的探讨低氧和抗氧化剂诱导醌氧化还原酶1(NQO1)基因表达及其与细胞增殖的关系和诱导表达的调节机制.方法人肝癌细胞SMMC-7721经抗氧化剂[酪醇(p-Ty),丁基羟茴香醚(BHA),β-萘黄酮(β-NF)]、低氧或两者共同处理24 h,分别采用微孔板测定法、RT-PCR、结晶紫显色法、电泳迁移率变动试验(EMSA)测定MQO1活力,NQO1mRNA表达,细胞增殖和细胞核蛋白与抗氧化反应元件(ARE)的结合情况.结果常氧下BHA,β-NF和p-Ty均能诱导NQO1比活力增加,酪醇诱导...
作者:侯志飞; 蒋栋; 赵学森; 曾辉 期刊:《中华实验和临床感染病》 2018年第02期
目的建立诱导表达IFITM3蛋白的293细胞株,为进一步研究人IFITM3对H1N1型流感病毒侵染的作用及其分子机制提供细胞模型。方法构建IFITM3/pc DNA5/FRT/TO expression vector质粒及诱导表达细胞株,建立H1N1型流感病毒假病毒评价系统,利用蛋白印迹(Western blot)和荧光素酶报告基因对筛选的诱导表达细胞株功能进行检测。结果建立的293诱导表达细胞株能够很好表达目的蛋白,且诱导表达出来的IFITM3蛋白使H1N1型流感假病毒感染率下降97%...
作者:王霞; 彭晓东; 黎光; 胡丽娟; 毕建虹 期刊:《中华医学遗传学》 2004年第06期
目的克隆抗人核内不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1,HnRNPA2/B1)单克隆抗体的重链可变区(variable region of heavy chain, VH)和轻链可变区(variable region of light chain, VL)基因,构建抗HnRNPA2/B1单链抗体(single chain Fv,ScFv)基因,并在大肠杆菌表达.方法采用斑点ELISA、Western印迹和免疫组化检测抗HnRNPA2/B1单克隆抗体3E8的特异性,并通过逆转录-聚合酶链反应、重叠延伸PCR来克隆、...
作者:秦云; 陈苏民; 关路媛; 陈南春; 张立藩 期刊:《医学争鸣》 2005年第03期
目的:克隆编码人骨形成蛋白4(hBMP4)成熟肽的cDNA基因,并在大肠杆菌中表达. 方法:从人胎盘组织中提取总RNA,以其为模板,采用RT-PCR方法得到编码hBMP4的成熟肽段(hBMP4m) cDNA,克隆入表达载体pDH2中,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达. 结果:获得hBMP4m cDNA基因,成功克隆入温度诱导表达载体pDH2,DNA序列分析证实所插入的hBMP4m cDNA序列与设计预期一致;将获得重组表达质粒pDH2-hBMP4m转化大肠杆菌DH5α中,经温度诱导,目的蛋白占细菌总...