作者:熊英环; 林千文; 吴湘涛; 张星亮 期刊:《广东医科大学学报》 2015年第04期
目的获得可用于蛋白晶体筛选的高纯度及构象均一的Nix蛋白。方法将Nix截断基因构建到原核载体并转化大肠杆菌。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后通过GST柱亲和纯化目标蛋白。TEV酶切除GST标签后采用凝胶过滤层析进一步纯化。结果 Nix截断基因成功构建到p GEX-4T-2并诱导表达了目标蛋白。通过GST亲和层析得到了可溶性的携带GST标签的Nix(2∽135)蛋白。切除GST标签的Nix(2∽135)通过凝胶过滤层析得到了构象均一的单体...
作者:赖燕来; 孙朝晖; 李鹏; 谢佐平 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2004年第05期
核受体相关因子1(nuclear receptor-related factor 1,Nurrl)是主要表达于中脑黑质及腹侧被盖区多巴胺能神经元的一种转录因子,属于核受体超家族成员,其功能性配体尚未被确认.研究表明,Nurrl对中脑多巴胺神经元的发育、存活以及成熟后功能的维持具有特殊重要意义.如能找到它的特异性配体,将为最终筛选出治疗帕金森病等中枢多巴胺失调性疾病的药物或化学合成先导物打下基础.为了获取Nurrl蛋白以标定其配体以及研究蛋白质间...
作者:韩斐; 赵睿骁; 王刚; 江明锋 期刊:《中国畜牧兽医》 2019年第11期
为提高胰高血糖素样肽-2(GLP-2)生产效率以适应畜牧生产应用的需求,本试验利用基因工程技术表达出定点诱变的p[Gly2]GLP-2。用甘氨酸取代GLP-2氨基末端第2位的丙氨酸后,再根据大肠杆菌的偏好性对p[Gly2]GLP-2序列进行优化并在目标肽序列N-端添加肠激酶识别位点,合成基因序列,通过KpnⅠ和XhoⅠ双酶切位点连接到pET-40b(+)构建原核重组表达载体p[Gly2]GLP-2-pET-40b(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达重组蛋白。...
作者:刘霞; 陶思齐; 翁涵; 梁英梅 期刊:《菌物学报》 2019年第09期
利用锈菌吸器特异性结合伴刀豆球蛋白Concanavalin A(ConA)的特性,用ConA-sepharose 4b作为层析介质,对自然状态下感染山田胶锈菌Gymnosporangium yamadae的绚丽海棠叶片以及接种亚洲胶锈菌G. asiaticum后不同发病时期沙梨叶片中胶锈菌的吸器进行分离,构建了吸器提取体系。结果表明,在感病叶片产生大量花斑时提取到这两种胶锈菌的完整吸器,经光学显微镜与透射电子显微镜观察,发现这两种胶锈菌的吸器形态相似,呈菌丝状或肾形或不规...
作者:朱碧云; 黄欣; 刘宝意; 李浩明 期刊:《广东药科大学学报》 2011年第01期
目的 克隆表达土曲霉洛伐他汀合成调控基因lovE,为研究lovE蛋白的生物学功能奠定基础。方法利用原核表达载体pET21b(+)构建lovE原核表达质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白。结果构建了pET—lovE原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得6×His—lovE融合蛋白,蛋白纯度在90%以上。结论原核表达可获得lovE蛋白,为lovE蛋白的生物学功能研究奠定了基础。
作者:苗景赟; 孙文改; 解红艳 期刊:《生物产业技术》 2009年第02期
作为生物药物的”重磅炸弹”,大规模动物细胞培养生产治疗用单克隆抗体(以下简称单抗)已成为生物制药发展的主导。Mabselect SuRe亲和层析结合Capto Adhere复合离子交换两步层析工艺已经成为抗体生产工艺的亮点,而中空纤维膜过滤技术是一种快速高效的膜分离技术,具有容尘量高、温和低剪切力、操作灵活、成本低、易于放大等优点.因此广泛应用于重组蛋白、疫苗等生物制药领域。通过将中空纤维膜过滤技术和下游两步层析工艺相结...
作者:马辉; 赵绪永 期刊:《现代牧业》 2007年第04期
以重组克隆载体pGEM-T—hsbp1为模板,PCR扩增hsbp1,用限制性内切酶双酶切、T4连接酶连接、转化BL-21的方法构建pGEX-2TK-hsbp1原核表达载体,实现了hsbp1在BL21中的表达,SDS—PAGE检测表达的融合蛋白主要以可溶形式存在,并利用亲和层析得到融合蛋白。
色层分离是样品混合液中各组分在固定相和流动相之间的一类差别分离。其机理尽管多种多样,但总是与样品混合液在流经层析剂时溶质相对于溶剂前缘的阻滞现象有关。大多数生物大分子都有能与专一性很强的配基相结合的生物功能。这种利用生物大分子与各种配基的生物识别能力进行色层分离的技术便是近年来迅速发展的一门新的有效的色层分离法——亲和色层分离法[1]。介绍了有关亲和层析的种类和发展方向,为读者展现了一个崭新的亲和层...
作者:蒋淑莲; 王念跃; 文剑; 赵伟; 吴引伟 期刊:《中国全科医学》 2007年第07期
目的建立一种特异的检测血清中肝癌特异性γ-谷氨酰转移酶(HS—GGT)的亲和层析方法,并观察HS—GGT对原发性肝癌(PHC)的鉴别诊断价值。方法采集64例PHC、22例肝外肿瘤、68例良性肝病及21例正常对照者的血清,以神经胺酸酶(NMD)水解后直接用欧曼陀罗凝集素(DSA)亲和层析柱分离,首先用柱平衡液洗脱不结合组分,再用50mmol/L醋酸洗弱结合组分,最后用100mmol/L醋酸洗脱强结合组分,用连续监测法测定各组分中的GGT活性,并分...
作者:崔雅璠; 丁樱 期刊:《中国医药导报》 2014年第17期
目的通过测定并比较紫癜性肾炎(HSPN)患儿及健康儿童血清IgA1水平,探讨IgA1对HSPN发病的影响。方法收集2013年5-12月河南中医学院第一附属医院儿科住院的HSPN患儿40例(HSPN组)及20名健康儿童(对照组)献血者血清,采用免疫比浊法测定HSPN患儿及健康儿童血清IgA的浓度:通过Jacalin亲和层析法分离、纯化血清,得到Jacalin结合蛋白,测定两组血清总IgA1浓度;Jacalin结合蛋白通过分子筛层析法分离,测定两组单聚体IgA1(mIgA1...
作者:彭亮; 廖祥儒; 张充; 吴立峰; 王博; 杨磊 期刊:《生物技术通报》 2004年第04期
环状糊精是由环状糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉所产生的一组非还原性环状低聚糖,最常见的有α,β和γ型,它们分别是由6、7或8个葡萄糖单元以α-1,4糖苷键联结而成的.由于其特殊的"内疏水外亲水"分子结构,使得环状糊精能与多种有机分子形成特殊结构的包合物;同时环状糊精还能与酶的活性/非活性部位相互作用,所以以环状糊精为配体,利用亲和层析纯化水解淀粉的酶类.
作者:付大伟; 孙莹莹; 徐伟 期刊:《中国生物工程》 2019年第03期
人核糖核酸酶抑制因子(human ribonuclease inhibitor,hRI)是一种能够调节核糖核酸酶活性的酸性包浆蛋白。通过构建含SUMO、IF2、GST、NusA、MsyB、Trx和MBP融合标签的重组表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌进行自诱导(auto-induction,AI)表达,从而使hRI的表达量得以提升。利用MagNi磁珠纯化及电泳分析hRI的表达状况,通过RNase/Sepharose亲和层析获得纯度较高的蛋白。纯化后获得的融合蛋白浓度为2 960.513mg/L,与其它公司的h...
作者:赵亚华; 徐伟; 高向阳; 董竟南 期刊:《中国生物工程》 2004年第10期
根据猪舒血管肠肽氨基酸序列推导、设计、合成了VIP基因.构建重组表达载体pPICZα-A-VIP.转化Pichia pastoris,在含100μg/ml Zeocin的YEPD平板上筛选.重组子经M-NTA介质亲和层析纯化并计算VIP的表达量约为1.25 g/L左右,纯化样品通过小分子质量电泳并与VIP标准样品迁移率对照进一步确定了舒血管肠肽已在巴斯德毕赤酵母中得到表达.
作者:张旭东; 王华生; 刘祖文; 闫海 期刊:《环境科学与技术》 2018年第01期
采用生物学技术对高效降解线性微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)的USTB-05-B酶进行克隆表达及纯化研究。首先利用分子克隆技术得到重组菌pET30a(+)/USTB-05-B/BL21(DE3)。在诱导剂IPTG浓度为0.25 mmol/L、温度30℃和诱导时间4 h条件下,重组菌能大量表达目的蛋白。然后利用亲和层析柱对重组菌破碎后的无细胞提取液(cell free extracts,CE)进行纯化,当咪唑浓度为100 mmol/L时,洗脱下来的蛋白纯度高。最终得到USTB-05-B...
作者:段瑞峰; 李刚; MatthiasGroszer; 胡迎春; 项晓琼; 吴虹; 吴德昌 期刊:《生物技术通讯》 2004年第04期
利用PCR和基因重组技术构建了三个小鼠pdd87基因的原核表达质粒:表达全长cDNA的pET-28a-pdd87质粒;表达PDD87C端404个氨基酸的pET-28a-pdd87-404质粒;表达全长cDNA的pMXB10-pdd87质粒。经IPTG诱导后三种质粒都得到表达。pET-28a-pdd87质粒和pET-28a-pdd87-404质粒表达的蛋白经His6亲和层析纯化后分别获得了带His标签的PDD87蛋白和含C端404个氨基酸的蛋白。pMXB10-pdd87质粒表达的蛋白经几丁质柱亲和层析纯化后获得了纯的PDD87蛋...
作者:魏敬双; 陶苒; 孙巍巍; 贾茜; 李川; 梁米芳 期刊:《生物工程学报》 2004年第02期
为克服血源免疫球蛋白制品的不足,开发了抗甲肝病毒基因工程单克隆抗体anti-HAV IgG.用无血清培养基培养rCHO工程细胞株,上清液经过rProtein A SFF亲和层析→脱盐→离子交换层析→超滤换液纯化后,所得anti-HAV IgG纯度达99%以上,比活性约100IU/mg,anti-HAV IgG活性回收率40%.所纯化的anti-HAV IgG分子量150kD,等电点8.4~9.3.免疫印迹实验证实anti-HAV IgG为人源全抗体分子.亲和层析介质rProtein A SFF确实存在亲和配基脱落问题,但...
作者:张弿; 关明; 吕元 期刊:《中华检验医学》 2005年第05期
目的用大肠杆菌表达色素上皮细胞衍生因子(PEDF),及评价其在脑胶质瘤血管新生中的作用. 方法构建pET41/PEDF表达载体,用金属亲和层析(His Tag)和阴离子交换层析纯化重组蛋白,并以管腔形成试验验证重组蛋白活性.同时,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血管内皮细胞生长因子(VEGF)与血小板反应素-1 (TSP-1)的变化.结果用基因工程手段获得终产量为3.8 mg/L,可抑制内皮细胞管腔形成的PEDF蛋白; PEDF可下调VEGF(减少1.8倍)和上调TSP-1(增...
作者:焦莉萍; 杨敏; 侯养全; 赵瑞君; 原发家; 杜斌; 王文建 期刊:《寄生虫与医学昆虫学报》 2012年第04期
为研究家蝇防御素融合蛋白对肿瘤细胞K562有抑制作用,在GenBank中检索家蝇defensin基因,设计特异引物,在家蝇幼虫组织中提取RNA,并通过PCR扩增defensin基因成熟肽部分(Maturedefensin,MD),将该基因与原核质粒表达载体pGEX.6P-1进行重组,构建家蝇抗菌肽重组蛋白pGEX-6P-1/MD。通过双酶切鉴定证明目的片段已稳定融合到载体pGEX-6P-1中并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中,经25℃IPTG诱导在大肠杆菌E.coliDH5u中表达。...
作者:蔡震; 梁自文; 罗向东; 杨宗城; 孙荣距; 苏踊跃 期刊:《中华烧伤》 2005年第05期
目的探讨通过金属螯合亲和层析的方法获得高纯度的人内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)蛋白的可行性.方法采用蛋白抽提试剂破菌方法抽提包涵体蛋白,初步纯化后在变性条件下用组氨酸标签结合树脂进行亲和层析,以透析方法复性,对纯化样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹法、肽质量指纹谱鉴定.结果EOLA1蛋白在大肠杆菌中的表达主要以包涵体形式存在,初步纯化的包涵体中蛋白纯度>75%,亲和层析纯化后获得的蛋白纯度高达90%以上,...