作者:李聪; 杨莹莹; 王美军; 陈己任 期刊:《分子植物育种》 2019年第24期
CRISPR/Cas9基因编辑系统是植物基因功能研究的重要工具,月季TCP9基因可以调控花器官的发育,应用CRISPR/Cas9技术构建敲除月季TCP9基因的表达载体,可以为月季TCP9基因的调控机制提供更多信息。根据TCP9基因的保守序列,设计了一对互补引物,用T4连接酶连接到质粒载体pKSE402 (该载体含有eGFP)中;通过测序确定所构建载体的正确性,通过冻融法将含有TCP9基因的重组质粒转入农杆菌(EHA105)中。以农杆菌为模板PCR扩增以及eGFP瞬时表达证明...
作者:胡巍; 陈志伟; 刘文 期刊:《生物学通报》 2015年第07期
以2种原核表达载体(pBV—IL1—His、目的基因-IL1融合表达载体)的构建为主要内容,设计了包含基因克隆、诱导表达、表达产物分离纯化与功能鉴定等相对独立又相互联系、逐步深入的系列实验,构成递进式的基因工程实验教学项目,具有操作性强、成本低、拓展和创新空间大、针对不同教学条件可选择多种教学方案等优势。
用PCR扩增出绿色荧光蛋白(GFP)基因,插入到pGEX-KG表达载体中,并将构建出的重组质粒命名为pKG-GFP. 将重组载体导入大肠杆菌DH10β中,经IPTG诱导产生GST-GFP融合蛋白,同时以可溶蛋白和包涵体两种形式存在.GST-GFP分子量大约为53kDa,与其理论值大小一致,用亲和层析以及凝血酶处理纯化GFP.纯化的产物经证实具有很好的均一性.以GFP免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,Western blotting测定抗血清效价.
作者:谭刚; 常国辉; 刘伯华; 刘洪; 韩伟国; 吕富双; 康晓萍; 张雨; 杨保安; 秦鄂德; 祝庆余 期刊:《中国生物化学与分子生物学报》 2005年第06期
将汉坦病毒H8205株G1P基因的保守序列(约1 000 bp)作为目的基因插入到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的pFastBac HTb供体质粒中,利用Tn7转座子同Bacmid DNA同源重组,获得了含目的基因片段的重组杆状病毒DNA,并利用其转染Sf9昆虫细胞,72 h后收集细胞悬液,再用该悬液侵染Sf9昆虫细胞,48 h后收获病毒.采用IFA分析收获的产物,观察到了特异性的荧光,并且采用SDS-PAGE和Western印迹也获得了与预期一致的结果.证明感染后的Sf9昆虫细胞所表达...
作者:尤佳; 张宁; 文义凯; 吴家和; 司怀军; 王蒂 期刊:《草业学报》 2014年第01期
利用In-Fusion技术将酶切位点不匹配、目的基因内部含载体酶切位点的CryⅢA基因和植物表达载体pBI121相连接,分别成功构建了组成型启动子CaMV 35S和马铃薯茎叶特异表达启动子ST-LS1驱动的CryⅢA基因植物表达载体.利用冻融法将2个重组质粒转入根癌农杆菌LBA4404,转化马铃薯栽培品种陇薯3号和甘农薯2号获得了转化植株,经卡那霉素筛选和PCR检测,共有10株阳性植株CryⅢA基因成功整合到马铃薯基因组中.经实时荧光定量PCR检测表明,CryⅢA...
作者:王琳; 向太和 期刊:《热带亚热带植物学报》 2009年第04期
通过RT—PCR从蓝色矮牵牛(Petunia hybrida)花瓣中克隆类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因(F3′,5′H)全长cDNA(GenBank登记号EF371021)。生物信息学分析表明克隆的F3′,5′H基因与GenBank登记号D14588、Z22545和DQ352142等的F3′,5′H基因序列高度一致;其编码的氨基酸序列与GenBank登记号BAA03438.1(矮牵牛)、BAC10997.1(银杯草)和AAV85470.1(马铃薯)的高度同源,同源率分别为99%、88%和87%。利用pBIN19、pBluescri...
作者: 期刊:《武汉生物工程学院学报》 2015年第04期
作者:王丽; 李洪; 张志霞; 刘晓燕; 谢华福; 宋杰; 梅志强 期刊:《西南医科大学学报》 2008年第03期
目的;获得JEVE蛋白基因,构建重组表达载体并在E.eoli中高效表达。方法:参照GeneBank中的日本乙型脑炎病毒SA14—14株序列设计一对特异性引物,采用RT—PCR法扩增E基因全长,克隆至PUCm—T载体,经测序证实后克隆至原核表达载体pET32a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS—PAGE电泳分析。结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了JEVE蛋白基因全长1500bp,成功构建了重组质粒pET-3...
<正>李佩甫的作品,是他对中原大地长久思虑的表达载体。因此,几乎每个人物、每个细节都有其内涵和意义。他笔下的人物形象有明显的几类:乡村统治者、青年一代、女性和广大贫弱庸众。其中,乡村统治者是李佩甫作品中最重要的一类人物形象,寄予作者
作者:单筠; 俞研迎; 龚建光; 毛克秋 期刊:《预防医学》 2009年第07期
MK(Midkine)是一种肝素结合性生长因子,最初发现与细胞生长、迁移和存活有关,随后的研究发现它在多种人源恶性肿瘤中高表达。新近研究显示MK能促进Wilm’s瘤细胞和成纤维细胞的生长、NIH3T3细胞的转化、用顺铂处理Wilm’s瘤细胞的抗凋亡活性以及诱导兔角膜强烈的血管生成应答。
作者:周奕阳; 李鹏; 谭之磊; 邓子新; 贾士儒; 欧竑宇 期刊:《湖南农业大学学报·自然科学版》 2019年第02期
鉴于ε-聚赖氨酸发酵过程对抗生素压力条件的依赖,尝试基于Ⅱ型毒素-抗毒素系统(relBE2sca)构建无选择压力下稳定表达ε-聚赖氨酸的淀粉酶产色链霉菌表达系统:将抗毒素基因 relB2sca与ε-聚赖氨酸合成酶基因pls克隆至表达载体,并导入淀粉酶产色链霉菌pls缺失突变株,将毒素基因relE2sca整合至淀粉酶产色链霉菌的染色体(突变株YY3),获得包含ε-聚赖氨酸稳定表达的突变株YY1。经过多次传代,相比对照组,在不含抗生素压力条件下,突变株YY1依...
作者:王烈峰; 徐敏雯 期刊:《赣南师范大学学报》 2006年第03期
饱和苯酚氯仿法提取Tg2576转基因鼠基因组DNA,PCR法扩增编码β-淀粉样蛋白的目的基因,利用基因克隆技术构建以β-淀粉样蛋白为靶的表达载体pcDNA3.1-Aβ42×2,应用酶切及测序鉴定表达载体.相应的双酶酶切能够获得插入的目的基因片段(为269bp),测序未发现突变,表达载体构建成功.
作者:徐伟; 魏苏; 陆晓媛 期刊:《徐州医科大学学报》 2010年第03期
目的通过构建骨桥蛋白(osteopontin,OPN)shRNA表达载体,探索卵巢癌基因治疗新途径。方法根据基因库上的OPN—mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接到线性化的pSilence质粒中,并对重组质粒进行酶切及序列鉴定。结果OPNsiRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致。结论靶向OPNshRNA表达载体的构建成功为研究降低卵巢癌OPN表达的抗肿瘤效应...
作者:黄高; 王文佳; 何光志; 田维毅; 蔡琨; 徐照; 曹峰; 付强 期刊:《时珍国医国药》 2013年第02期
目的为了构建贵州银杏果抗真菌肽基因(GZ-gb)的表达载体。方法采用BamH I和Hind III酶切的pMD18-T-GZ-gb和pET32a(+)质粒,纯化回收产物进行反应,将连接产物pET32a(+)-GZ-gb转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后,经菌落PCR、酶切鉴定和测序。结果表明目的片段成功插入表达载体。结论 pET32a(+)-GZ-gb可以用来制备抗真菌蛋白。
作者:刘惠龙; 卞毅; 丁凤菲; 李馥洁 期刊:《中外医疗》 2009年第02期
目的构建miR-16表达载体,为研究miR-16对HBV的干扰作用打下基础。方法根据miRNA的成熟序列以及附近约100多碱基共270个碱基序列,设计PCR引物,PCR扩增,退火后用T4联接到线性化的pSUPER质粒中,并对重组质粒(命名为pmiR-16)进行酶切及测序鉴定。结果成功构建了重组质粒PmiR-16。结论成功构建miR-16表达载体。
作者:李鹏辉; 费洪新; 王立红; 许惠玉; 张海燕 期刊:《中国现代医生》 2017年第06期
目的 构建PDCD5基因真核表达载体,并电转染BGC823细胞,获得稳定转染细胞。方法 设计合成PDCD5基因片段,将其插入经Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切的pc DNA3.1+表达载体,菌落PCR和基因测序进行鉴定。重组质粒电转染BGC823细胞,G418筛选数周后PCR鉴定稳定转染细胞。结果 重组质粒经菌落PCR测序分析表明,PDCD5基因序列准确插入预期位置,且序列正确。重组质粒成功电转染BGC823细胞,并整合入细胞基因组DNA。结论 成功构建了PDCD5基因真核表达载...
作者:罗炼芳; 苏俊波 期刊:《安徽农学通报》 2013年第21期
该实验拟构建甘蔗14-3-3基因的真核表达载体,为体外研究该蛋白功能和高级构象特征奠定基础。用RT—PCR技术从甘蔗茎中扩增出编码14-3-3蛋白的全长基因,并连入pGEM—T载体中,双酶切和测序用于序列正确性的鉴定。结果表明,该基因的最大开放阅读框为771bp,编码6256个氨基酸。后将所得cDN段亚克隆至真核表达载体pPIC9K,经电转后在酵母细胞中表达,表达产物经Westernblot鉴定分子量约为28kD。表明已成功构建了甘蔗14—3—3蛋白真...
作者:李云; 曾东平; 曾振灵 期刊:《中国兽药》 2014年第09期
利用已经构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的表达载体和一个含有鸡溶菌酶基因超敏感位点4(hypersensitivity site 4)的载体pBS-HS4,采用Polybrene的方法进行稳定共转染T47D细胞得到稳定转染细胞株,结果得到了87株稳定转染细胞株。用10-9mol/L 17β-雌二醇诱导筛选,结果标号为EGFP-T47D 74的克隆细胞株在诱导后72 h及96 h表现出非常强的诱导荧光,而且诱导倍数较大,为3.63倍。结果表明,试验筛选出的稳定转染重组细胞株可...
作者:丁力; 唐琳; 赵国强; 戚敏; 吴红霞; 周炳英 期刊:《河南医学高等专科学校学报》 2005年第05期
目的构建肝素酶(heparanase,Hpa)反义RNA真核表达载体.方法提取胃癌组织总RNA,按照GenBank中检索出的Hpa基因cDNA序列,设计并合成反义Hpa基因片段的引物,进行RT-PCR,并将扩增产物克隆至pGEM-T载体,PCR鉴定及测序证实后,双酶切pGEM-T-antiHpa重组体回收目的片段,再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中,并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析.结果PCR扩增出的反义片段与预期长度相符.构建的Hpa反义RNA表达质粒pcDNA3.1-antiHpa,分...